Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01NS046835 ו R01AG034389, ואת מצעד הפרוטות מענק 6FY08-322. תודה מיוחדת מוקדשת גב &#39;אלינור בראון (Miltenyi BIOTEC, אובורן, CA) שעזר מאוד עם תובנה אותה טכנולוגיה MACS. Miltenyi סיפקה בנדיבות את החומר המשמש הפגנה של הניסויים ללא עלות. אני אסירת תודה גם לד&quot;ר Guanghu וואנג (Medical College של גאורגיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה, אוגוסטה, GA) מי שהפיק את PKCζ להביע שורות תאים. תמיכה על ידי המכון לרפואה מולקולרית בבית הספר לרפואה של גרוזיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה (בניהולו של ד&quot;ר לין מי) הוא גם הודה.

1. הקדמה שלפוחית ​​בתיווך זיקה השומנים באמצעות כרומטוגרפיה המגנטי המופעל מיון תאים (LIMACS) הטכניקה פותחה במעבדה שלנו לבודד ceramide הקשורים קומפלקסים חלבונים 1-3. במקור, שלפוחית ​​השומנים היו עשויים ceramide ו phosphatidylserine, שאיפשר MACS בא...

<ol>
	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

כדי לבחון את האינטראקציה בין השומנים ספציפי לבין חלבון מחייב שלה הקשו על ידי הטבעה של שומנים בקרום התא. קרום התא מורכב מתערובת של שומנים וחלבונים כמה זה מאורגן microdomains שומנים או רפסודות. לכן, שיתוף טיהור microdomains וחלבונים לא יכול להבחין בבירור אם החלבון נקשר ישירות שומנ...

Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים MACS מיקרו minicolumns סופקו על ידי Miltenyi BIOTEC, Inc (אובורן, CA). שומנים כולם היו הגבוהים ביותר של טוהר המתקבל ליפידים אוואנטי פולאר (אלבסטר, א.ל.).

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

ניתוח של אינטראקציה חלבון שומנים קשה בגלל שומנים המוטבעים קרום התא ולכן נגיש הליכי טיהור ביותר. כחלופה, שומנים יכולים להיות מצופים על משטחים שטוחים כמו משמש השומנים ELISA ו Plasmon ספקטרוסקופיית תהודה. עם זאת, ציפוי משטח שומנים לא יוצרים מבנים microdomain, אשר עשוי להיות חשוב עבור המאפיינים מחייב השומנים. יתר על כן, שיטות אלו אינן מאפשרות לטיהור של כמויות גדולות יותר של חלבונים מחייב שומנים היעד שלהם. כדי להתגבר על המגבלות האלה של בדיקת חלבון אינטראקציה שומנים לטהר חלבונים מחייב השומנים פיתחנו שיטה חדשה המכונה שלפוחית ​​בתיווך זיקה השומנים באמצעות כרומטוגרפיה המגנטי המופעל מיון תאים (LIMACS). בשיטה זו, שלפוחית ​​השומנים מוכנים עם השומנים היעד phosphatidylserine כמו שומנים עוגן עבור Annexin V MACS. Phosphatidylserine הוא נמצא בכל מקום קרום התא פוספוליפידים המציגה בזיקה גבוהה Annexin החלבון V. שימוש חרוזים מגנטיים מצומדות כדי Annexin V phosphatidylserine המכילים שומנים שלפוחית ​​יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים. כאשר שלפוחית ​​השומנים מודגרת עם תא lysate חלבון מחייב השומנים היעד יהיה גם חייב את החרוזים יכול להיות שותף מטוהרים באמצעות MACS. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבדוק אם חלבונים רקומביננטי מחדש מורכב חלבון מחייב השומנים היעד. השתמשנו בשיטה זו כדי להראות את האינטראקציה של PKC טיפוסיות (aPKC) עם ceramide sphingolipid ואת התגובה הערמונית שיתוף לטהר אפופטוזיס 4 (PAR-4), חלבון מחייב aPKC ceramide הקשורים. יש לנו גם השתמשו בשיטה זו בריאורגניזציה של מורכבות ceramide הקשורים של aPKC רקומביננטי עם הקוטביות בתא חלבונים הקשורים Par6 ו Cdc42. מאז שלפוחית ​​השומנים ניתן להכין עם מגוון רחב של sphingo או פוספוליפידים, LIMACS מציע מבחן תכליתי עבור אינטראקציה שומנים החלבון בסביבה השומנים הדומה באופן הדוק לזה של קרום התא. חלבון נוסף מתחמי השומנים ניתן לזהות באמצעות ניתוח proteomics של חלבון שומנים מחייב שיתוף מטוהרים עם שלפוחית ​​השומנים.

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית ​​השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

שילוב מיון מגנטי של תאי אמא ומבחני תנודות לנתח חוסר יציבות הגנום במהלך הזדקנות תא mitotic ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...