Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
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この作品は、NIHの助成金R01NS046835とR01AG034389、そしてダイム助成6FY08 - 322の月によってサポートされていました。特別あなたがMACS技術に彼女の洞察力で大いに役立った夫人エレノアブラウン（Miltenyi Biotec社、オーバーン、カリフォルニア州）に捧げられる感謝。ミルテニーは、気前よく無料での実験のデモンストレーションのために使用される材料を提供しています。私はまた、細胞株の発現PKCζを生成博士広滬王（グルジア/グルジア健康科学大学の医科大学、オーガスタ、ジョージア州）に感謝しています。グルジア/グルジア健康科学大学（リン博士は梅の指揮下）の医科大学分子医学研究所のサポートも認められている。

1。はじめ磁気活性化セルソーティング（LIMACS）技法を用いて脂質小胞を媒介としたアフィニティークロマトグラフィーは、セラミド結合蛋白質複合体1-3を分離するために我々の研究室で開発されました。もともと、脂質の小胞は小胞とその関連蛋白質を分離するために磁性粒子標識アネキシンVを（ホスファチジルセリンに非常にアフィン）を使用してMACSに許可?...

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	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

脂質とその結合タンパク質間の特異的な相互作用をテストすることは細胞膜の脂質から埋め込むことによって妨げられている。細胞膜には、いくつかの脂質とタンパク質の混合物から成り、それは、脂質ミクロドメインまたは筏で構成されています。蛋白質が直接脂質に結合するかだけミクロドメイン構造に富んでいるそのため、マイクロドメインとタンパク質の共精製は、はっきりと区別?...

アネキシンV -共役磁気ビーズとMACSマイクロとminicolumnsはミルテニーバイオテク株式会社（オーバーン、カリフォルニア州）から提供された。すべての脂質は、最高純度のものであったとAvanti極性脂質（アラバスター、AL）から入手。

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

脂質はほとんどの精製操作にアクセスできない、したがって、細胞膜に埋め込まれているため、脂質タンパク質の相互作用の解析は困難です。別の方法として、脂質は脂質ELISAとプラズモン共鳴分光法のために使われる平らな表面上に塗布することができる。しかし、表面コーティングの脂質は、脂質結合特性のために重要であるかもしれない、ミクロドメイン構造を形成しない。さらに、これらのメソッドは、それらの標的脂質に結合する蛋白質の大量の精製のために許可されていません。 脂質のタンパク質相互作用をテストするのこれらの限界を克服し、脂質結合タンパク質を精製するために、我々は磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる新しい方法を開発した。この方法では、脂質小胞は、アネキシンV MACSのためのアンカーの脂質のようなターゲットの脂質、ホスファチジルセリンを用いて調製されています。ホスファチジルセリンはタンパク質アネキシンに高い親和性を示すVのホスファチジルセリン含有脂質の小胞は、磁性ビーズに結合するアネキシンVに結合した磁気ビーズを用いたユビキタス細胞膜のリン脂質である。脂質の小胞がライセート、細胞とインキュベートされている場合、ターゲット脂質への結合タンパク質はまた、ビーズに結合され、MACSを用いて共同で精製することができる。この方法は、組換えタンパク質の再構成する場合、対象脂質に結合するタンパク質複合体をテストするために使用することができます。 我々は、スフィンゴ脂質セラミドとし、共同浄化前立腺アポトーシス応答4（PAR - 4）、セラミド関連aPKCの結合タンパク質への非定型PKC（aPKC）との相互作用を表示するには、このメソッドを使用している。我々はまた、細胞極性関連タンパク質Par6およびCdc42との組換えaPKCのセラミド関連複合体の再構築のためにこのメソッドを使用している。脂質小胞がsphingo -またはリン脂質のさまざまな準備ができるので、LIMACSはその細胞膜の酷似脂質環境における脂質 - タンパク質相互作用のための多目的なテストを提供しています。追加の脂質蛋白質複合体は、脂質結合タンパク質、脂質小胞との共精製のプロテオミクス解析を用いて同定することができる。

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Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

そのターゲットの脂質とタンパク質の相互作用をテストするために我々は、MACSとターゲットの脂質とアネキシンV結合ホスファチジルセリンから合成されたアネキシンV -共役磁気ビーズと脂質小胞を使用。ターゲットの脂質に結合したタンパク質は、共同で精製し、ビーズから溶出した後に分析されます。

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

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