Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
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이 작품은 NIH 보조금 R01NS046835과 R01AG034389, 그리고 천 부여 6FY08 - 322 3 월 지원했다. 특별한 당신이 맥을 기술에 그녀의 통찰력과 함께 엄청난 도움을 부인 엘리 노어 브라운 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)에 전념합니다 감사합니다. Miltenyi은 아낌없이 무료로 실험의 시연에 사용되는 자료를 제공하고 있습니다. 또 세포 라인을 표현 PKCζ을 생성 박사 ​​Guanghu 왕 (조지아 / 조지아 보건 과학 대학, 오거 스타의 메디컬 칼리지, GA)에 감사드립니다. 조지아 / 조지아 보건 과학 대학 (박사 린 메이의 지도자의 임기 미만)의 의료 대학에서 분자 의학 연구소에 의해 지원도 인정받고 있습니다.

1. 소개 자기 - 활성화된 셀 정렬 (LIMACS) 기법을 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피는 ceramide - 관련 단백질 단지가 1-3 분리하기 위해 연구실에서 개발되었습니다. 원래, 지질 vesicles는 vesicles과 관련된 단백질을 분리하는 자기 입자 - 복합 Annexin V를 (phosphatidylserine 고도로 affine)를 사용하여 Mac 용 허용 ceramide와 phosphatidylserine의되었다. 이 ceramide - 연결된 극성...

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	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

지질과 결합 단백질 간의 특정 상호 작용을 테스트하려면 것은 세포막의 lipids의 포함에 의해 방해합니다. 세포막은 여러 lipids과 단백질의 혼합물로 구성되어 있으며, 그것은 지질 microdomains이나 보트로 구성됩니다. 단백질 직접 지질에 바인딩 또는 유일한 microdomain 구조에 풍부한 경우 따라서 microdomains 및 단백질의 공동 정화 명확하게 구별 수 없습니다. 이러한 지질 ELISAs 또는 Plasmon 공명 분광법?...

Annexin V - 복합 자성 구슬과 맥을 마이크로와 minicolumns은 Miltenyi Biotec, 주식 회사 (오번, CA)에 의해 제공되었다. 모든 lipids은 최고 순도되었으며 아반티 폴라 Lipids (엘라 베스터, AL)에서 얻은.

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

lipids 대부분의 정화 절차에 접근할 그러므로 세포 점막에 포함된하고 있기 때문에 지질 단백질 상호 작용의 분석 어렵습니다. 대안으로, lipids은 지질 엘리사와 Plasmon 공명 분광법을 위해 사용되는 평면 표면에 코팅하실 수 있습니다. 그러나, 표면 코팅 lipids은 지질 바인딩 속성에 대해 중요한 수있는, microdomain 구조를 형성하지 않습니다. 또한, 이러한 방법들은 목표 lipids에 바인딩 단백질의 대용량의 정화를 위해 허용하지 않습니다. 지질 단백질 상호 작용을 테스트 이러한 한계를 극복하고 지질 바인딩 단백질을 정화하기 위해 우리는 자기가 활성화된 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 친화 크로마 토그래피를 칭했다 소설 방법을 개발했습니다. 이 방법에서는 지질 vesicles는 Annexin V Mac 용 앵커 지질로 대상 지질 및 phosphatidylserine와 준비가되어 있습니다. Phosphatidylserine는 단백질 Annexin V. phosphatidylserine 함유 지질 vesicles는 자성 비즈에 바인딩됩니다 Annexin V에 복합 자기 구슬을 사용하여 높은 친화력을 보여주는 유비 쿼터스 세포막의 인지질이다. 지질 vesicles이 lysate 세포와 incubated 경우 대상 지질에 바인딩 단백질도 비즈에 바인딩되며, 맥을 사용하는 공동 정화 수 있습니다. 이 방법은 테스트하는 데 사용할 수있는 재조합 단백질은 reconstitute 대상 지질에 바인딩 단백질 컴플렉스를하는 경우. 우리는 sphingolipid ceramide와 공동 정화 전립선 apoptosis 반응 4 (파 4), ceramide - 관련 aPKC에 바인딩 단백질 비정형 PKC (aPKC)의 상호 작용을 표시하기 위해이 방법을 사용했습니다. 우리는 또한 세포 극성과 관련된 단백질 Par6 및 Cdc42와 재조합 aPKC의 ceramide - 연결된 복합 reconstitution이 방법을 사용했습니다. 지질 vesicles가 sphingo 또는 phospholipids의 다양한 준비할 수 있기 때문에 LIMACS은 세포막의 밀접하게 유사한 지질 환경에서 지질 - 단백질 상호 작용에 대한 다양한 테스트를 제공합니다. 추가 지질 단백질 단지는 지질 바인딩 단백질 지질 vesicles 공동 정화의​​ proteomics 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다.

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Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

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Biology

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Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

식물 Protoplasts의 형광 활성 세포 정렬

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

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불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

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낮은 친화력 세포 수용체 - 리간드 상호 작용의 확장 가능한 감지를위한 욕망 기반의 세포 상호 작용 검사 (AVEXIS)

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단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

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의 세포 구체적인 분석<em&gt; Arabidopsis</em&gt; 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

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어머니 세포 및 변동 시험의 자기 정렬을 결합에서 유사 분열 세포 노화 동안 게놈 불안정성을 분석합니다<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

탠덤 선호도 정화를 사용하여 MyoD 상호 작용 체의 식별 질량 분석에 결합

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...