Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01NS046835 e R01AG034389, ea March of Dimes conceder 6FY08-322. Um agradecimento especial é dedicado a Sra. Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), que ajudou tremendamente com a sua visão sobre a tecnologia MACS. Miltenyi generosamente forneceu o material utilizado para a demonstração dos experimentos, sem nenhum custo. Agradeço também ao Dr. Guanghu Wang (Medical College of Geórgia / Georgia Health Sciences University, Augusta, GA), que gerou o PKCζ expressar linhas celulares. Apoio por parte do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Geórgia / Georgia Health Sciences University (sob direção do Dr. Lin Mei) também é reconhecido.

1. Introdução A cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas usando magnético-activated cell sorting (LIMACS) técnica foi desenvolvida em nosso laboratório para isolar complexos ceramida-proteína associada 1-3. Originalmente, as vesículas lipídicas eram feitas de ceramida e fosfatidilserina, o que permitiu a MACS usando partículas magnéticas conjugado com anexina V (altamente afim de fosfatidilserina) para isolar as vesículas e suas proteínas associadas. T...

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	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

Para testar a interação específica entre um lipídio e sua proteína de ligação é prejudicada pela incorporação de lipídios na membrana da célula. A membrana celular consiste de uma mistura de lipídios e proteínas diversas e é organizado em microdomínios lipídicos ou jangadas. Portanto, o co-purificação de proteínas microdomínios e não pode distinguir claramente se uma proteína diretamente liga-se a um lipídio ou só é enriquecido em uma estrutura microdomínio. Outros métodos usando lipídios de...

Anexina V conjugada esferas magnéticas e MACS micro e minicolunas foram fornecidos pela Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). Todos os lipídios foram de maior pureza e obtido a partir de Lipídeos Avanti Polar (Alabaster, AL).

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

A análise de interação proteína lipídica é difícil porque os lipídios são incorporados nas membranas celulares e, portanto, inacessíveis para a maioria dos procedimentos de purificação. Como alternativa, os lipídios podem ser revestidos em superfícies planas como as usadas em lipídios ELISA e ressonância Plasmon espectroscopia. No entanto, lipídios revestimento de superfície não formam estruturas microdomínio, que pode ser importante para as propriedades de lipídios vinculativo. Além disso, estes métodos não permitem a purificação de grandes quantidades de proteínas de ligação a lipídeos seu alvo. Para superar essas limitações dos testes de interação de proteínas lipídios e purificar proteínas de ligação de lipídios foi desenvolvido um novo método denominado de lipídios cromatografia de afinidade vesícula mediada magnética usando-activated cell sorting (LIMACS). Neste método, vesículas lipídicas são preparados com os lipídios alvo e fosfatidilserina como os lipídios âncora para anexina V MACS. Fosfatidilserina é um fosfolipídio de membrana onipresente celular que mostra alta afinidade à proteína anexina V. Usando esferas magnéticas conjugadas a anexina V vesículas lipídicas contendo fosfatidilserina-se ligará à esferas magnéticas. Quando as vesículas lipídicas são incubadas com uma célula lisado a proteína de ligação ao lipídios alvo também será obrigado a as contas e pode ser co-purificado utilizando MACS. Este método também pode ser usado para testar se proteínas recombinantes reconstituir um complexo de proteínas de ligação ao lipídios alvo. Temos utilizado este método para mostrar a interação da PKC atípica (aPKC) com a ceramida sphingolipid e co-purificar resposta a apoptose de próstata 4 (PAR-4), uma proteína de ligação a ceramida associada aPKC. Temos também utilizado este método para a reconstituição de um complexo de ceramidas associados da aPKC recombinante com a célula de polaridade proteínas relacionadas Par6 e Cdc42. Desde vesículas lipídicas pode ser preparado com uma variedade de esfingo ou fosfolipídios, LIMACS oferece um teste versátil para lipídios proteínas de interação em um ambiente de lipídios que se assemelha de perto o da membrana celular. Complexos de proteína adicional de lipídios pode ser identificado através da análise proteômica de proteínas lipídios vinculativo co-purificada com as vesículas lipídicas.

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Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

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High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

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A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

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Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

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Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combinando Sorting magnética de células mãe e testes de flutuação para Analisar Genoma Instabilidade Durante Mitotic envelhecimento celular em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

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Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

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Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...