Name: lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction
Uploaded: 2011-04-26T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe programı R01NS046835 ve R01AG034389 ve Dimes hibe 6FY08-322 Mart tarafından desteklenmiştir. MACS teknolojisi, onun bakış açısı ile muazzam yardımcı Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) için ayrılmış özel bir teşekkür ediyorum. Miltenyi cömertçe deneyler gösteri için hiçbir ücret ödemeden kullanılan malzeme sağladı. Ben de hücre hatları ifade PKCζ oluşturulan Dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Augusta, GA) minnettarım. Destek Gürcistan / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi (Dr Lin Mei müdürlüğüne altında) Tıp College Moleküler Tıp Enstitüsü tarafından da kabul edilmektedir.

1. Giriş Manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) tekniği kullanılarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi 1-3 seramid ile ilişkili protein kompleksleri izole etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir. Başlangıçta, lipid veziküller manyetik partikül konjuge Annexin V (fosfatidilserin için son derece ilgin) kullanarak MACS veziküller ve ilişkili proteinler izole etmek için izin seramid ve fosfatidilserin yapılmıştır. Seramid ile ilişkili bir polarite...

<ol>
	<li>Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+binding+to+ceramide+activates+protein+kinase+Czeta+before+the+formation+of+a+pro-apoptotic+complex+with+PAR-4+in+differentiating+stem+cells.">Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells.</a> J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).</li><li>Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carboxyl-terminal+domain+of+atypical+protein+kinase+Czeta+binds+to+ceramide+and+regulates+junction+formation+in+epithelial+cells.">The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells.</a> J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).</li><li>Chalfant, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+ceramide+regulates+the+alternative+splicing+of+caspase+9+and+Bcl-x+in+A549+lung+adenocarcinoma+cells.+Dependence+on+protein+phosphatase-1.">De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1.</a> J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).</li><li>Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exchange+of+C(16)-ceramide+between+phospholipid+vesicles.">Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles.</a> Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).</li><li>Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysics+(and+sociology)+of+ceramides.">Biophysics (and sociology) of ceramides.</a> Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).</li><li>Kumagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CERT+mediates+intermembrane+transfer+of+various+molecular+species+of+ceramides.">CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides.</a> J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).</li></ol>

Hücre zarında lipid gömerek bir lipid ve bağlayıcı protein arasında belirli bir etkileşim test etmek için bir engel teşkil etmektedir. Hücre zarı, birkaç lipitleri ve proteinleri karışımından oluşur ve lipid microdomains veya sallar düzenlenmiştir. Bu nedenle, bir protein, lipid doğrudan bağlar ya da sadece bir microdomain yapısı zenginleştirilmiş microdomains ve proteinlerin ortak arıtma açıkça ayırt edemez. Lipid ELISA&#39;larla veya Plasmon rezonans spektroskopi gibi yüzeyleri kaplanm?...

Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve MACS mikro ve minicolumns Miltenyi Biotec, Inc (Auburn, CA) tarafından verilmiştir. Tüm lipidler yüksek saflıkta ve Avanti Polar lipidler (Alabaster, AL) elde edilen.

lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic activated cell sorting (limacs): a novel method to analyze protein-lipid interaction

Lipidler çoğu arıtma prosedürleri erişilemez duruma, bu nedenle hücre zarlarında gömülü ve çünkü lipid protein etkileşim analizi zordur. Alternatif olarak, lipidler, lipid ELISA ve Plazmon rezonans spektroskopi için kullanılan gibi düz yüzeyler üzerinde kaplı olabilir. Ancak, yüzey kaplama lipidler, lipid bağlayıcı özellikleri için önemli olabilir microdomain yapılar oluşturmak yok. Ayrıca, bu yöntemleri, hedef lipidler bağlayıcı proteinlerin büyük miktarlarda arıtma için izin vermez. Lipid protein etkileşim test bu sınırlamaları aşmak ve lipid bağlayıcı proteinlerin arındırmak için manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) kullanarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, lipid veziküller Annexin V MACS çapa lipid olarak hedef lipid ve fosfatidilserin ile hazırlanmıştır. Fosfatidilserin protein Annexin V. fosfatidilserin içeren lipid veziküller manyetik boncuk bağlamak Annexin V konjuge manyetik boncuklar kullanarak yüksek afinite gösteren her yerde bulunan bir hücre zarı fosfolipid. Hedef lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller lizat bir hücre ile inkübe edilir boncuklar bağlı olacak ve MACS kullanarak ortak arındırılmalıdır. Bu yöntem ayrıca test etmek için kullanılır rekombinant proteinler sulandırmak hedef lipid bağlayıcı bir protein kompleksidir. Biz sphingolipid seramid ve co-purify prostat apoptozis cevabı 4 (PAR-4), seramid ilişkili aPKC için bağlayıcı bir protein atipik PKC (aPKC) etkileşimi göstermek için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca hücre polarite ilgili proteinler Par6 ve Cdc42 rekombinant aPKC seramid ile ilişkili kompleks sulandırıldıktan için bu yöntemi kullanmıştır. Lipid veziküller sphingo-veya fosfolipitler çeşitli hazırlanmış olabilir, hücre zarından yakından benzer bir lipid ortamda LIMACS lipid-protein etkileşim için çok yönlü bir test sunuyor. Ek lipid protein kompleksleri lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller ile birlikte arıtılmış proteomik analizi kullanılarak tespit edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction at JoVE.com

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Research

JoVE Journal

Biology

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk Kullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Combining Magnetic Sorting of Mother Cells and Fluctuation Tests to Analyze Genome Instability During Mitotic Cell Aging in Saccharomyces cerevisiae

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Saccharomyces cerevisiae has been an excellent model system for examining mechanisms and consequences of genome instability. Information gained from this ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Tandem Affinity Arıtma kullanarak MyoD interaktom belirlenmesi kütle spektrometresi ile birleştiğinde

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Bir Tandem Affinity Etiket Yöntemiyle Yapısal Çalışmaları Yerli Komplekslerinin saflaştırılması

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...