Name: high-throughput measurement and classification of organic p in environmental samples
Uploaded: 2011-06-08T13:00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples at JoVE.com

Мы благодарим и Геологической службы США Вермонт водных ресурсов и озеро Центра исследований для предоставления финансирования.

1. Фосфор Добыча <ol><li> Подготовка 1L решения 0,25 М раствора гидроксида натрия (NaOH, 40,00 г / моль) + 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 292,24 г / моль). </li><li> Добавить 30 мл NaOH + раствором ЭДТА до 2 г влажной или сухой почвы / образца в 50 мл коническую трубку. </li><li> Инкубируйте при перемешивании в течение 16 часов при комнатной температуре. </li><li> Центрифуга 3000 мкг в течение 3 минут. </li></ol> 2. Пример извлечения рН регулировки <ol><li> Передача 0,1 мл аликвоту в 1,5 мл микро-центрифуги трубы. </li><li> Добавить 0,017 мл 2,5 М уксусной кислоты, 0,144 мл 0,4 М ацетатного буфера (70,5% ацетата натрия [CH 3 COONa, 82,03 г / моль] и 29,5% уксусной кислоты, рН 5,0), и 0,739 мл деионизированной воды. </li><li> Конечный объем скорректированного экстракт будет 1 мл и окончательное рН будет 5,0. </li></ol> 3. Фермент маточного раствора Подготовка <ol><li> Подготовка 1 л 0,1 М ацетата натрия (CH 3 COONa, 82,03 г / моль) растворе, рН 5,0. </li><li> Подготовка 2 х 10 мл растворов кислот фосфатазы складе в буфере ацетата натрия, подготовленный в шаге 3,1, что окончательные концентрации каждого 0,5 ед / мл. Кислая фосфатаза типа I с Triticum aestivum (зародыши пшеницы, ГП, как правило, 0,5 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2) Кислая фосфатаза типа IV-S от Solanum tuberosum (картофель, РР, как правило, 4,6 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2) * Единицы активности определяются поставщиком, где 1 единица определяется как освобождение от 1 мкмоль ортофосфат для раствора в час при 37 ° C. </li><li> Разведите лиофилизированный нуклеазы P1 (ЕС 3.1.30.1) из Penicillium citrinum (грибы; NP1, как правило, 500 U мг -1 твердые) в одном мл деионизированной воды-это теперь можно хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования. </li><li> Внесите NP1 в один из 10 мл трубы подготовлен в п. 3.2, что конечная концентрация составляет 2,5 ед / мл NP1; осторожно перемешать путем обращения в несколько раз. </li><li> Центрифуга двух 10 решений мл фермента 3000 мкг в течение 30 минут. </li></ol> 4. P Кривая калибровки и управления <ol><li> Подготовка 1 л на 1 мМ фосфат калия (К2НРО4, 174,18 г / моль) исходного раствора. </li><li> Добавить 1 мл 1 мМ маточного раствора калия фосфата 1,5 мл трубки центрифуги и выполнять семь 0,5 мл серийные разведения. </li><li> Откажитесь от первого трубку так, у вас есть 7 разведений от 20 нмоль-0,625 нмоль П. </li><li> Передача 80 мкл из каждой пробирки в двух экземплярах на строки B - Н от стандартного 96-луночного планшета. </li><li> Добавить 80 мкл буферного раствора ацетата натрия (раздел 3.1) к ряду колонн 11 и 12-это 0 нмоль P точки калибровки. </li><li> В каждом столбце 11 и 12 теперь содержит 8 эталонных образцов от 0 до 20 нмоль нмоль неорганического фосфата. </li><li> Колонка 10 будет содержать следующие элементы управления: <ol><li> Добавить 40μL ПП + GP раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия (раздел 3.1) для первых трех скважин в колонке 10. </li><li> Добавить 40 мкл ПП + GP + NP1 раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия в течение следующих трех скважин. </li><li> Добавить 40 мкл раствора ацетата натрия, содержащего 10 нмоль глюкозо-6 фосфата (C 6 H 11 Na 2 O 9 P &amp;bullet; хН 2 O, 304,1 г / моль) + 40 мкл ПП + GP фермента решения для одной хорошо, и в финал также в колонке 10 добавить раствор ацетата натрия вместо раствора фермента. </li></ol></li></ol> 5. Образец + фермент инкубации <ol><li> Каждый образец проходит испытания займут первые 9 скважин в 1 ряд стандартных 96-луночного планшета. </li><li> Распределить 40 мкл рН с поправкой на экстрактах образцов из раздела 2 к скважинам в 1-9 до 8 строк. </li><li> После всех образцах были распространены * использовать многоканальную пипетку для распространения ПП + GP раствора фермента в столбцы 1-3, ПП + GP + NP1 в столбцы 4-6 и буферного раствора ацетата натрия (подготовлен в разделе 3.1) в столбцы 7-9. * На этом этапе должны быть выполнены быстро, чтобы заверить всех образцах получить эквивалентное время инкубации. </li><li> Обложка 96-луночный планшет с крышкой и инкубировать образцы + фермент решений, контроля и калибровочной кривой ровно 1 час при температуре 37 ° C. </li></ol> 6. Колориметрический Измерение выхода и история неорганической P <ol><li> Подготовка 50 мл каждого из следующих решений в деионизованной воде: Решение *: 0,1 М аскорбиновой кислоты (C6H8O6, 176,12 г / моль) + 0,5 М трихлоруксусной кислоты (Cl3CCOOH, 163,39 г / моль) Раствор В: 0,01 M молибдата аммония ((NH4) 2MoO4, 196,01 г / моль) Решение C: 0,1 М цитрат натрия (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 г / моль) + 0,2 М натрия арсенат (NaAsO2, 129,91 г / моль) + 5% ледяной уксусной кислоты (CH3CO2H, 60,05 г / моль) * Решение должно быть готово в день. </li><li> Добавьте 25 мкл раствора SDS, 100 мкл раствора, 20 мкл Б решение и 50 мкл раствора и C для всех скважин в 96-а плели. Делайте это быстро многоканальную пипетку. </li><li> Обложка пластинки и инкубировать 30 минут при комнатной температуре. </li><li> Измерьте оптическую плотность при 850 нм в любом перестраиваемых микро-ридер. </li></ol> 7. Классификация соединений P <ol><li> Импорт исходных данных в электронных таблицах (например, Microsoft Excel). </li><li> Участок неорганического фосфора калибровочной кривой: от 0 до 40 нмоль P на ось х и среднее дубликатов измерения абсорбции на вертикальной оси. </li><li> Выполните линейной регрессии и найти уравнение линии наилучшего соответствия. </li><li> Столбцы 1-3: Непосредственно применять калибровочной кривой-это фон неорганических П. </li><li> Столбцы 4-6: Средние значения образца трех экземплярах и вычесть из контрольной группы (раствор фермента + P фоне неорганической) от валового абсорбции-это Р основе гидролизуемых моноэфиры P. </li><li> Столбцы 7-9: То же, за исключением 7,5 вычесть значения абсорбции из столбцов 4-6 - это P из гидролизуемых диэфиры P. </li><li> Преобразование абсорбции данные нмоль P выпущен с применением калибровочного уравнения. </li><li> нмоль P выпустили могут быть связаны обратно в мг Р / кг оригинальных почвы. Кроме того, оценка пропорций каждого класса P также может быть полезным подходом для анализа данных. </li></ol> 8. Представитель Результаты: Быстрый визуальный осмотр 96-луночного планшета после колориметрических химии предложит подсказки или нет процедура была выполнена правильно. Первое, что проверка уровня жидкости в каждую лунку при сканировании бокового профиля пластины. Там должно быть ровно 275 мкл реагентов во всех скважинах. Затем осмотрите цвет скважин трех экземплярах образца и дублировать калибровки скважин. Эти технические репликации должна быть такой же оттенок синего. Затем нанесите калибровочной кривой для двух скважин содержащих глюкозо-6 фосфата и убедиться, что они освободили всех 10 нмоль неорганических П. После полного извлечения P была измерена с помощью ICP-OES или альтернативный метод, убедитесь, что общая P значений, рассчитанных с помощью этого Протокол не может превышать сумму P, который был извлечен. Примечание: Тщательное управление данными в электронной таблице поможет защититься от количественных ошибок. Вы будете иметь дело с большим количеством номеров сразу, поэтому создание шаблона будет время хорошо провели. <img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. 96-луночного планшета Отображение результатов для 8 образцов (строки АГ) и калибровочной кривой (столбцы 11 и 12). Органы управления в колонке 10. Цвет повышение интенсивности между столбцами 1-3 и 4-6 происходит из-за гидролизованный моноэфира P соединений между столбцами 4-6 и 7-9 происходит из-за гидролизованных соединений P эфира. <img src="/files/ftp_upload/2660/2660fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Распределение классов П в 0,25 М NaOH-0,05 М ЭДТА экстракт образца почвы Вермонт использованием высокой пропускной ферментативного гидролиза. Ошибка полоски показывают стандартное отклонение, п = 3.

<ol>
	<li>Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Organic phosphorus in the environment. , (2005).</li><li>Murphy, J., Riley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+single+solution+method+for+determination+of+phosphate+in+natural+waters.">A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters.</a> Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).</li><li>Dick, W. A., Tabatabai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+orthophosphate+in+aqueous+solutions+containing+labile+organic+and+inorganic+phosphorus+compounds.">Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds.</a> J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).</li><li>He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+hydrolysis+approach+for+characterizing+labile+phosphorus+forms+in+dairy+manure+under+mild+assay+conditions.">An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions.</a> Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).</li><li>He, Z., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates.">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).</li><li>Cade-Menun, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+phosphorus+in+environmental+and+agricultural+samples+by+31P+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Talanta. 66, 359-371 (2005).</li><li>Johnson, N. R., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+species+composition+of+poultry+manure-amended+soil+using+high-throughput+enzymatic+hydrolysis.">Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

По самой своей природе, экспресс-метод с использованием малых объемах требует большой осторожности. Поэтому наиболее важные шаги тех, которые связаны пипетирования решений на тарелку. Точная и, самое главное, в соответствии технику пипетки имеют важное значение для успеха этого анализа. NaOH-ЭДТА добычи позволит большую часть P во многих образцах, характеризуется на три класса: ортофосфат, моноэфира P и диэфира П. Почвы, удобрения, осадков или любые другие экологические образца, который содержит NaOH-ЭДТА-извлекаемые P может быть охарактеризовано . P формы в пробах окружающей среды, не обязательно стабильное и эта техника будет обеспечивать образцы характеризуются, прежде чем образцы оказываются под угрозой, без необходимости использовать армию исследователей. Этот анализ особенно удобна при большом количестве образцов, подлежащих обработке. Реагент потребности и пространства требования были уменьшены до приемлемого уровня (например, 1,5 мл микроцентрифужных трубы, а не 50 мл колб стекла). Это приспособление также ограничивает отходов производства.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td></tr><tr><td> ЭДТА </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> EDS </td></tr><tr><td> Ледяная уксусная кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242853 </td></tr><tr><td> Ацетата натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S2889 </td></tr><tr><td> Пшеница кислой фосфатазы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3627 </td></tr><tr><td> Фосфатазы картофеля кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1146 </td></tr><tr><td> Нуклеазы P1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N8630 </td></tr><tr><td> Фосфат калия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2222 </td></tr><tr><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Глюкозо-6 фосфат </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7250 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr><tr><td> Аскорбиновая кислота </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5960 </td></tr><tr><td> TCA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9159 </td></tr><tr><td> Молибдата аммония </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1343 </td></tr><tr><td> Цитрат натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S1804 </td></tr><tr><td> Арсената натрия </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9663 </td></tr></tbody></table>

high-throughput measurement and classification of organic p in environmental samples

Многие виды органического фосфора (Р) молекулы существуют в пробах окружающей среды 1. Традиционные измерения P не обнаруживают этих органических соединений P, так как они не реагируют с колориметрическим реагентов 2,3. Ферментативный гидролиз (ГБ) является новым методом точно характеризующие органических форм фосфора в пробах окружающей среды 4,5. Этот метод только сфабрикованным в точности, фосфор-31 спектроскопия ядерного магнитного резонанса (31 Р-ЯМР)-метод, который стоит дорого и требует специальных технических training6. Мы адаптировали метод ферментативного гидролиза способны измерять три класса фосфора (моноэфира Р, Р диэфира и неорганических P) к системе микропланшетов читателя 7. Этот метод обеспечивает исследователей с быстрой и точной, доступной и удобной средства измерения P видов почв, осадков, удобрений и, в случае концентрированной, водных образцов. Это только высокую пропускную способность метода измерения формы и ферментом лабильность органических P, которые могут быть выполнены в стандартных лабораторных условиях. Полученные данные дает представление для ученых, изучающих системы содержания питательных веществ и эвтрофикации потенциал.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples at JoVE.com

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Этот протокол описывает высокой пропускной метод ферментативного гидролиза, которая использует микропланшетного для измерения и классификации фосфора в почве, как P моноэфиры, Р диэфиры и неорганических П. До 96 образцов могут быть измерены в свое время в стандартных лабораторных условиях.

Высокая пропускная измерения и классификации органических P в пробах окружающей среды

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Абсолютный квантовый выход Измерение порошковых проб

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Высокая пропускная метод измерения скорости клубочковой фильтрации в сознании Мыши

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Высокая пропускная способность<em&gt; Данио Rerio</em&gt; Анализ Расход энергии

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Точный, высокой пропускной способности анализ роста бактерий

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Высок объём измерение сапротрофные discoideum макропиноцитозом, поток цитометрии

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...