Name: preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays at JoVE.com

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	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

Une fois fait correctement les analyses décrites dans ce protocole devrait donner une image représentative de la capacité des cellules NK à l&#39;encontre dégranulent et Lyse VIH-1 des cellules infectées (voir figure 5). Dégranulation des cellules NK dans la réponse au VIH des cellules infectées et les cellules NK lyse des cellules infectées par le VIH doit être directement proportionnelle 10. Des résultats fiables pour les deux dosages de cellules NK fonctionnelles pour mesurer les réponses cytotoxiques pour les cellules infectées par le VIH sont dépendants de l&#39;isolement des cellules NK hautement purifié ainsi que d&#39;une population hautement purifiée de cellules infectées. Ayant purifié les cellules NK et le VIH-1 des cellules infectées sont essentielles pour la réalisation d&#39;un effecteur assez précis pour objectif de ratio de cellules. De même, l&#39;élimination des cellules mortes et l&#39;apoptose des populations de cellules cibles est importante avant 51 Cr étiquetage ou l&#39;incubation avec les cellules effectrices. 51 Cr peut être internalisé par les cellules qui subissent l&#39;apoptose comme la présence de cellules mortes ou apoptotiques pendant l&#39;étape de marquage isotopique donnera lieu à un communiqué de haute spontanée et de fausser la lyse% calculé spécifiques. Par ailleurs, la présence de cellules mortes ou apoptotiques peuvent déclencher la dégranulation des cellules NK résultant en des niveaux anormalement élevés d&#39;expression CD107a. Pipetage précis est nécessaire pour retirer les surnageants acellulaires après incubation des cellules NK et les cellules cibles dans les 51 tests de libération de Cr, comme des différences dans le volume de surnageant retiré de chaque répétition et se traduira par haute déviations standard. Des modifications peuvent être apportées à ces protocoles pour évaluer le rôle des récepteurs spécifiques dans le déclenchement de NK NK lyse des cellules infectées par le VIH des cellules en incubant les effecteurs ou les cibles avant de co-culture avec des anticorps antagonistes des récepteurs spécifiques ou ligands 6,11. Cytokine-traitée cellules NK (par exemple, l&#39;IL-2, IL-15) peut être utilisé pour évaluer la fonctionnalité des cellules NK stimulées 12. De même, les anticorps des dosages de cytotoxicité cellulaire dépendante peut être effectuée en utilisant ces protocoles. Anticorps anti-VIH (par exemple, anti-gp120) peuvent être ajoutés à des cellules cibles pour la reconnaissance par les récepteurs des cellules NK CD16 faible affinité Fc 13. Ces tests, bien que mis en place pour mesurer les réponses des cellules NK cytotoxiques pour les cellules infectées par le VIH, peut également être modifiée pour mesurer la capacité des cellules NK à produire des cytokines après la reconnaissance des cellules infectées par le VIH. Bien que nous avons décrit dans ce protocole l&#39;utilisation de cellules in vitro infectées que les cellules cibles, nous avons récemment décrit la génération des cellules cibles de patients infectés par le VIH. Cela nécessite l&#39;isolement des cellules T CD4 + cellules suivie d&#39;une expansion des cellules sur une période de deux semaines après stimulation par des mitogènes, en présence d&#39;interleukine-2 11. Après la période de deux semaines d&#39;expansion, les protocoles décrits dans cet article sont utilisés pour isoler les cellules cibles.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

Natural killer (NK) sont une composante essentielle de la réponse immunitaire innée au virus des cellules infectées. Il est important de comprendre la capacité des cellules NK de reconnaître et de lyser le VIH-1 des cellules infectées parce identifier toute aberration dans la fonction des cellules NK contre les cellules infectées pourrait potentiellement mener à des thérapies qui permettraient d&#39;améliorer leur activité cytolytique. Il est nécessaire d&#39;utiliser infectés par le VIH des cellules T primaires explosions comme cellules cibles infectées plutôt que-lignées de lymphocytes T dans les tests de cytotoxicité. Lignées cellulaires T, même sans infection, sont très sensibles à la lyse des cellules NK. Par ailleurs, il est nécessaire d&#39;utiliser des cellules autologues primaires pour prévenir les grandes classes complexe majeur d&#39;histocompatibilité, je inadéquation entre la cible et de cellules effectrices qui se traduira par la lyse. Les premières études évaluant les réponses des cellules NK cytolytiques primaires aux cellules infectées a échoué à montrer tuant significative de l&#39;1,2 cellules infectées. Cependant, en utilisant le VIH-1 primaires de cellules T comme cellules cibles des cellules NK dans les dosages fonctionnels a été difficile en raison de la présence de cellules non infectées contaminent 3. Cette cellule infectée incompatibles ratio de cellules non infectées se traduira par la variation de tuer des cellules NK entre les échantillons qui peuvent ne pas être dû à la variabilité en fonction des donneurs de cellules NK. Ainsi, il serait bénéfique de travailler avec une population de cellules infectées purifiée afin d&#39;uniformiser l&#39;effecteur à la cible cellulaire ratios entre les expériences 3,4. Ici nous démontrons l&#39;isolement d&#39;une population hautement purifiée de VIH-1 des cellules infectées en prenant avantage de la capacité du VIH-1 à bas moduler CD4 sur les cellules infectées et la disponibilité de kits commerciaux pour enlever les cellules mortes ou mourantes 3-6. Le purifiée infectés primaires de cellules T explosions peuvent ensuite être utilisés comme cibles soit dans une dégranulation ou dosage cytotoxique des cellules NK purifiées que la population effectrice 5-7. Utilisation des cellules NK comme effecteurs dans un essai de dégranulation évalue la capacité d&#39;une cellule NK pour libérer le contenu lytique des lysosomes spécialisés 8 appelées «granules cytolytiques&quot;. Par coloration avec un anticorps conjugué contre le fluorochrome CD107a, une protéine membranaire lysosomale qui devient exprimé à la surface des cellules NK cytolytiques lorsque les granulés fusionner à la membrane plasmique, nous pouvons déterminer quel est le pourcentage de cellules NK dégranulent en réponse à la reconnaissance des cellules cibles. Alternativement, l&#39;activité lytique des cellules NK peut être évaluée dans un essai cytotoxique qui permet la détermination du pourcentage de cellules cibles lysées par la libération de 51 Cr au sein de la cellule cible, en présence de cellules NK.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Des essais de cytotoxicité à mesurer les réponses des cellules tueuses naturelles lytique aux cellules infectées est limitée par la pureté des cellules cibles. Nous démontrons ici l&#39;isolement d&#39;une population hautement purifiée de VIH-1 primaires de cellules T explosions en profitant de la capacité du VIH-1 s à bas moduler CD4.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

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