Name: preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays at JoVE.com

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	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

제대로하면이 프로토콜에서 설명한 assays는 반대 degranulate 및 HIV - 1 감염 세포를 (그림 5 참조) lyse하는 NK 세포의 능력의 대표 사진을 제공해야합니다. HIV에 감염된 세포와 NK 세포의 용해 HIV에 감염된 세포에 대한 응답으로 NK 세포 degranulation 10 직접 비례한다. HIV에 감염된 세포에 세포 독성 반응을 측정하는 두 NK 세포 기능 assays에 대한 신뢰할 수있는 결과에 높은 NK 세포뿐만 아니라 감염된 세포의 높은 정화 인구 정화의 고립에 의존하고 있습니다. NK 세포와 HIV - 1 감염 세포가 세포 비율을 대상으로 상당히 정확하게 이펙터의 달성을 위해 중요하다. 투석을 갖는 마찬가지로, 대상 세포 집단에서 죽은 및 apoptotic 세포의 제거는 효과기 세포와 51 피크 라벨 또는 부화하기 전에 중요합니다. 51 CR은 동위 원소의 분류 단계에서 죽은 apoptotic 세포의 존재로 apoptosis를 겪고 아르 세포 internalized 수 있습니다 높은 자발적인 릴리스의 결과하고 계산 % 특정 용해를 왜곡합니다. 또한, 죽은이나 apoptotic 세포의 존재는 CD107a 표현의 비정상적으로 높은 수준의 결과로 NK 세포 degranulation를 실행할 수 있습니다. 정확한 pipetting는 51 피크 릴리스 assays의 NK 세포와 표적 세포의 배양 다음 셀 무료 supernatants를 제거하면, 필요한 각 복제에서 제거 뜨는의 볼륨의 차이뿐만 아니라 높은 수준의 편차가 발생합니다. 수정은 특정 수용체 또는 리간드 6,11에 대립 항체와 공동 문화 사전 effectors이나 목표를 잠복기에 의해 HIV에 감염된 세포 NK 세포의 용해를 실행에서 특정 NK 수용체의 역할을 평가하는 이러한 프로토콜을 만들 수 있습니다. 시토킨 - 처리 NK 세포 (예, IL - 2, IL - 15) 자극 NK 세포를 12의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 항체 의존 세포 세포 독성의 assays 이러한 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있습니다. 안티 HIV 항체 (예, 안티 - gp120) NK 세포 낮은 친화 FC 수용체 CD16 13에서 인식의 대상 세포에 추가할 수 있습니다. HIV에 감염된 세포 NK 세포 세포 독성 반응을 측정하는 설정이지만 이러한 assays은 또한 HIV에 감염된 세포 인식 아래 크린 시토킨 생산 NK 세포의 능력을 측정하기 위해 수정할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜의 목표 세포로 체외 감염된 세포에의 사용을 설명하지만 우리는 최근에 HIV에 감염된 환자에서 대상 세포의 생성을 설명합니다. 이것은 CD4 + T - 세포가 인터루킨 - 2 11의 존재에 mitogens와 자극을 다음과 같은 두 주간 기간 동안 세포의 확장에 의해 다음의 절연을 필요로합니다. 확장의 두 주 기간 후,이 문서에서 설명하는 프로토콜은 대상 세포를 분리하는 데 사용됩니다.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

자연 킬러 (NK) 세포가 바이러스에 감염된 세포에 타고난 면역 반응의 중요한 구성 요소입니다. 그것은 HIV에 감염된 세포로부터 NK 세포 기능에 aberrancy를 식별하기 때문에 잠재적으로 자신의 cytolytic 활동을 강화 것입 치료로 이어질 수 HIV - 1 감염 세포를 인식하고 lyse하는 NK 세포의 능력을 이해하는 것이 중요합니다. 오히려 다음 목표 세포를 세포 독성의 assays에 감염된 - T - 세포 라인으로 HIV에 감염된 기본 T - 세포의 폭발을 사용하려면 필요가있다. T - 세포 라인, 심지어 감염없이 NK 세포 용해에 매우 취약합니다. 또한, 그것은 용해가 발생합니다 대상과 효과기 세포 사이에 난 불일치 주요 histocompatibility 복합 클래스를 방지하기 위해 autologous 기본 세포를 사용해야합니다. 기본 HIV에 감염된 세포 NK 세포 cytolytic 반응을 평가하는 초기 연구는 감염된 세포의 1,2의 상당 살해를 표시하지 못했습니다. 그러나, 사용하는 HIV - 1을 NK 세포 기능 assays의 대상 세포로 감염된 기본 T - 세포가 감염되지 않은 세포에게 3 오염의 존재를 인해 어려운되었습니다. 감염되지 않은 세포의 비율이 일관성이 감염된 세포는 기증자 NK 세포 기능의 변화로 인해하지 않을 수 있습니다 표본 간의 NK 세포 죽이는에서 편차가 발생합니다. 그러므로, 그것은 실험 3,4 사이의 세포 비율을 대상으로 이펙터를 표준화하기 위해 정화 감염된 세포 인구 작업 도움이 될 것입니다. 여기는 죽었거나 죽어가는 세포에게 3-6 제거 감염 세포 및 상업 키트의 가용성에 아래쪽 조절 CD4에 HIV - 1의 능력을 활용하여 HIV - 1 감염 세포의 높은 정화 인구의 절연을 보여줍니다. 정화 감염된 기본 T - 세포 폭발 그런 다음 5-7 효과기 인구로 NK 세포를 정화와 degranulation 또는 세포 독성 분석 중 하나의 대상으로 사용할 수 있습니다. degranulation 분석에 effectors로 NK 세포의 이용 8 &quot;cytolytic 과립 &#39;라는 전문 lysosomes의 lytic 내용을 공개하는 NK 세포의 능력을 평가합니다. CD107a, cytolytic 과립은 플라즈마 막에 퓨즈 NK 세포 표면에 표현된다 lysosomal 멤브레인 단백질에 대한 fluorochrome 복합 항체와 얼룩으로, 우리는 세포 인식 대상에 대한 응답으로 degranulate NK 세포의 비율을 결정할 수 있습니다. 또는, NK 세포 lytic 활동이 NK 세포의 존재에있는 대상 세포 내에서 51 피크의 릴리스에 의해 lysed 대상 세포의 비율의 결정을 허용 세포 독성 분석에 평가할 수있다.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

HIV에 감염된 세포 자연 킬러 세포 lytic 응답을 측정하기 위해 세포 독성의 assays는 대상 세포의 순도에 의해 제한됩니다. 우리는 여기서 CD4 아래로 조절하는 HIV - 1의 능력을 활용하여 HIV - 1 감염 기본 T - 세포 폭발의 고도 정화 인구의 절연을 보여줍니다.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

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세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

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기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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인공 항원은 세포 (aAPC) 중재의 활성화와 자연 킬러 T 세포의 확장을 제시

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

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Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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