Name: preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays
Uploaded: 2011-03-14T11:00:00
Duration: 12 min 7 s
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	<li>Ruscetti, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+effector+mechanisms+against+HTLV-I-+and+HTLV-III/LAV-infected+lymphoid+cells.">Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells.</a> J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).</li><li>Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparent+ineffectiveness+of+natural+killer+cells+vis-a-vis+retrovirus-infected+targets.">Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets.</a> J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).</li><li>Ferrari, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clade+B-based+HIV-1+vaccines+elicit+cross-clade+cytotoxic+T+lymphocyte+reactivities+in+uninfected+volunteers.">Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).</li><li>Shankar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+function+of+circulating+HIV-specific+CD8(+)+T+cells+in+chronic+human+immunodeficiency+virus+infection.">Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection.</a> Blood. 96, 3094-3101 (2000).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Vpr+triggers+natural+killer+cell-mediated+lysis+of+infected+cells+through+activation+of+the+ATR-mediated+DNA+damage+response.">HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response.</a> PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).</li><li>Ward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+modulates+the+expression+of+ligands+important+in+triggering+natural+killer+cell+cytotoxic+responses+on+infected+primary+T-cell+blasts.">HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts.</a> Blood. 110, 1207-1214 (2007).</li><li>Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+human+immunodeficiency+virus-infected+primary+T-cell+blasts+by+autologous+natural+killer+cells+is+dependent+on+the+ability+of+the+virus+to+alter+the+expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules.</a> Blood. 104, 2087-2094 (2004).</li><li>Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+mechanisms+in+cell-mediated+cytotoxicity.">Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).</li><li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding.">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> J Virol. 74, 10074-10080 (2000).</li><li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity.">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).</li><li>Fogli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysis+of+endogenously+infected+CD4++T+cell+blasts+by+rIL-2+activated+autologous+natural+killer+cells+from+HIV-infected+viremic+individuals.">Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals.</a> PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).</li><li>Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK+cell+lysis+of+HIV-1-infected+autologous+CD4+primary+T+cells:+requirement+for+IFN-mediated+NK+activation+by+plasmacytoid+dendritic+cells.">NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells.</a> J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).</li><li>Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-C+and+HLA-E+reduce+antibody-dependent+natural+killer+cell-mediated+cytotoxicity+of+HIV-infected+primary+T+cell+blasts.">HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts.</a> Aids. 18, 1769-1779 (2004).</li></ol>

Cuando se hace correctamente los ensayos descritos en este protocolo debe proporcionar una imagen representativa de la capacidad de las células NK a degranulación en contra y lisis de VIH-1 las células infectadas (ver Figura 5). Degranulación de las células NK en la respuesta al VIH de las células infectadas y las células NK lisis infectadas por el VIH debe ser directamente proporcional 10. Resultados confiables para los dos ensayos con células NK funcionales para medir las respuestas citotóxicas para las células infectadas con VIH dependen del aislamiento de las células NK altamente purificada, así como una población altamente purificada de células infectadas. Después de haber purificado las células NK y el VIH-1 las células infectadas son fundamentales para el logro de un efector bastante precisa de la relación de células objetivo. Del mismo modo, la eliminación de células muertas y la apoptosis de las poblaciones de células diana es importante antes de 51 Cr etiquetado o la incubación con las células efectoras. 51Cr puede ser internalizado por las células que se someten a la apoptosis como la presencia de células muertas o apoptosis durante la fase de etiquetado de isótopos dará como resultado una liberación espontánea de alto y se distorsiona la lisis% calculado específicos. Además, la presencia de células muertas o apoptosis puede desencadenar la degranulación de las células NK que resulta en niveles anormalmente altos de expresión CD107a. Pipeteo preciso es necesario cuando la eliminación de los sobrenadantes libres de células después de la incubación de las células NK y células diana en los 51 ensayos de liberación de Cr, como las diferencias en el volumen de sobrenadante retirado de cada réplica y se traducirá en alta desviaciones estándar. Se pueden hacer modificaciones a estos protocolos para evaluar el papel de los receptores específicos NK en la activación de las células NK lisis de células infectadas con VIH mediante la incubación de los efectores u objetivos antes de co-cultivo con anticuerpos antagonistas de receptores específicos o ligandos 6,11. Tratados de citoquinas de las células NK (por ejemplo, IL-2, IL-15) se puede utilizar para evaluar la funcionalidad de estimular las células NK 12. Del mismo modo, dependiente de anticuerpos ensayos de citotoxicidad celular se puede realizar utilizando estos protocolos. Anticuerpos anti-VIH (por ejemplo, anti-gp120) se pueden añadir a las células diana para el reconocimiento de la célula NK receptor de baja afinidad Fc CD16 13. Estos ensayos, aunque creada para medir las respuestas de las células NK citotóxicas para las células infectadas con VIH, también puede ser modificado para medir la capacidad de las células NK para producir citoquinas tras el reconocimiento de células infectadas por el VIH. A pesar de que se describe en este protocolo el uso de células in vitro infectadas como células diana se han descrito recientemente la generación de las células diana de pacientes infectados con el VIH. Para ello es necesario el aislamiento de las células CD4 + células T seguida por la expansión de las células durante un período de dos semanas después de la estimulación con mitógenos, en presencia de interleucina-2 11. Después del período de dos semanas de la expansión, los protocolos descritos en este artículo se utilizan para aislar las células diana.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>367874</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>StemCell Technologies</td>
<td>15062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30256.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lymphocyte Separation Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-072-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI-1640</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30096.01 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SV30010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>25-005-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T-cell Expansion Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-441</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CMF HBSS (1x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30588.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>46-034-Cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NK Cell Negative Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IMDM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>12440-046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4+ Positive Isolation Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>113.31D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polybrene</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>sc-134220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD3 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>558117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD14 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>325616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD20 PacificBlue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>302328</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD56 APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biolegend</td>
<td>318310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD69 PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD107a FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>555800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>51Chromium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>NEZ030002MC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamma Counter Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>1270-401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2470 Automatic Gamma Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>2470-0050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Diva</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickenson</td>
<td>643629</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FlowJo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TreeStar</td>
<td>FJ-9-1YR</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation and use of hiv-1 infected primary cd4+ t-cells as target cells in natural killer cell cytotoxic assays

Asesinas naturales (células NK) son un componente esencial de la respuesta inmune innata a células infectadas por virus. Es importante entender la capacidad de las células NK para reconocer y lisar el VIH-1 las células infectadas por la identificación de cualquier aberración en función de las células NK contra las células infectadas con VIH podría conducir a terapias que mejoren su actividad citolítica. No hay necesidad de utilizar infectadas por el VIH primaria de células T explosiones como células diana en lugar de infectados-T-líneas celulares en los ensayos de citotoxicidad. Líneas de células T, incluso sin la infección, son muy susceptibles a la lisis de las células NK. Además, es necesario el uso de células autólogas primaria para prevenir las principales clases complejo de histocompatibilidad que los desajustes entre el objetivo y la célula efectora que dará lugar a la lisis. Los primeros estudios evaluar las respuestas de las células NK citolítica de primaria de las células infectadas no muestran matando significativa de 1,2 células infectadas. Sin embargo, con VIH-1 primario de células T como las células diana en ensayos de células NK funcionales ha sido difícil debido a la presencia de contaminación de las células no infectadas 3. Esta célula infectada inconsistentes con la proporción de células no infectadas se traducirá en una variación en la muerte de las células NK entre las muestras que no puede ser debido a la variabilidad en función de los donantes de las células NK. Por lo tanto, sería beneficioso para trabajar con una población de células infectadas purificada a fin de normalizar el efector para apuntar relaciones entre los experimentos de células 3,4. Aquí se demuestra el aislamiento de una población altamente purificada del VIH-1 las células infectadas por el aprovechamiento de la capacidad del VIH-1 para abajo modular CD4 en las células infectadas y la disponibilidad de kits comerciales para eliminar las células muertas o moribundas 3-6. La infección primaria purificada de células T explosiones se puede utilizar como objetivos, ya sea en un ensayo de desgranulación o citotóxicos, células NK purificadas como la población 5-7 efector. El uso de las células NK como efectores en un ensayo de desgranulación evalúa la capacidad de una célula de NK para liberar los contenidos lítica de los lisosomas especializados 8 llamada &quot;gránulos citolíticos&quot;. Mediante la tinción con un anticuerpo conjugado con fluorocromo contra CD107a, una proteína de membrana lisosomal que se expresa en la superficie de las células NK, cuando los gránulos citolíticos fusionan con la membrana plasmática, se puede determinar qué porcentaje de las células NK en respuesta a la degranulación objetivo el reconocimiento de la célula. Por otra parte, la actividad lítica de las células NK puede ser evaluado en un ensayo citotóxico que permite la determinación del porcentaje de células diana zadas por la liberación de 51 Cr desde el interior de la célula diana en la presencia de células NK.

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Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Ensayos de citotoxicidad para medir las respuestas de las células asesinas naturales lítica de células infectadas con VIH se ve limitada por la pureza de las células diana. Estamos aquí demostrar el aislamiento de una población altamente purificada de VIH-1 primario de células T explosiones mediante el aprovechamiento de la capacidad del VIH-1 s de abajo modular CD4.

Preparación y uso de VIH-1 en células CD4 infectadas Primaria + T-células como células diana en las células asesinas naturales ensayos citotóxicos

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