Name: thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy
Uploaded: 2011-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy at JoVE.com

Wij danken Beijing Wu voor het gebruik van haar gegevens. Dit werk werd ondersteund door een NSF LOOPBAAN award aan Jek

1. De voorbereiding van ~ 50 nm diameter Kleine unilamellaire Blaasjes (SUV&#39;s) voor het membraaneiwit Folding <ol><li> Een oplossing van 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) lipiden in chloroform is gekocht en aliquotted in schone glazen flacons in 20 mg per flacon hoeveelheden voor opslag. Een laag van stikstof gas wordt toegevoegd aan elke flacon om lipide oxidatie te voorkomen, en de flesjes worden afgesloten met caps en parafilm. De flacons worden opgeslagen in een -20 ° C vriezer tot geb...

<ol>
	<li>Shirley, B. A., Shirley, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+and+Analysis+of+Urea+and+Guanidine+Hydrochloride+Denaturation+Curves.">Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves.</a> Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).</li><li>Lau, F. W., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Assessing+the+Stability+of+a+Membrane+Protein.">A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein.</a> Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).</li><li>Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Barrel+Proteins+that+Reside+in+the+Escherichia+coli+Outer+Membrane+in+Vivo+Demonstrate+Varied+Folding+Behavior+in+Vitro.">&#946;-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro.</a> J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).</li><li>Booth, P. J., Curnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+scene+investigation:+membrane+proteins.">Folding scene investigation: membrane proteins.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).</li><li>Hong, H., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+coupling+of+integral+membrane+protein+stability+to+lipid+bilayer+forces.">Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).</li><li>Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Tryptophan+Microenvironment,+Soluble+Domain,+and+Vesicle+Size+on+the+Thermodynamics+of+Membrane+Protein+Folding:+Lessons+from+the+Transmembrane+Protein+OmpA.">Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA.</a> Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).</li></ol>

Het huidige protocol beschrijft de generatie van ontvouwen curves van membraan-geassocieerde eiwitten en peptiden die tryptofaan residuen bevatten. Hier wordt ervan uitgegaan dat de tryptofaan fluorescentie weerspiegelt de vraag of het eiwit is gevouwen en ingevoegd in synthetisch lipide vesicles, of ongevouwen in oplossing. Aanvullende hypothesen, zoals de twee-staten-vouwen en lineaire afhankelijkheid van de vrije energie met denaturant concentratie, worden gemaakt in het huidige verslag;. Wijziging van deze aannames ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850345C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biochemicals</td>
<td>04821527</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P288</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P285</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

thermodynamics of membrane protein folding measured by fluorescence spectroscopy

Membraaneiwit vouwen is een opkomende onderwerp met zowel fundamenteel en gezondheid-gerelateerde betekenis. De overvloed van membraaneiwitten in cellen ligt ten grondslag aan de noodzaak van een omvattende studie van de vouwen van deze alomtegenwoordige familie van eiwitten. Daarnaast hebben ontwikkelingen in ons vermogen om ziekten die samenhangen met verkeerd gevouwen eiwitten te karakteriseren gemotiveerd belangrijke experimentele en theoretische inspanningen op het gebied van eiwitten vouwen. Snelle vooruitgang op dit belangrijke gebied is helaas gehinderd door de inherente uitdagingen in verband met membraaneiwitten en de complexiteit van het klapmechanisme. Hier schetsen we een experimentele procedure voor het meten van de thermodynamische eigenschap van de Gibbs vrije energie van ontvouwing in de afwezigheid van denaturerende, Δ G ° H 2 O, voor een representatieve integrale membraaneiwit van E. coli. Dit protocol richt zich op de toepassing van fluorescentie spectroscopie te bepalen evenwicht populaties van in-en uitklapbaar staten als een functie van de denatureringsmiddel concentratie. Experimentele overwegingen voor de bereiding van synthetische lipide vesicles, alsook de belangrijkste stappen in de data-analyse procedure worden gemarkeerd. Deze techniek is veelzijdig en kan worden nagestreefd met verschillende typen denatureringsmiddel, zoals temperatuur en pH, maar ook in diverse omgevingen vouwen van lipiden en micellen. Het huidige protocol is er een die kan worden gegeneraliseerd naar een membraan of oplosbaar eiwit dat de set van criteria die hieronder besproken voldoet.

Watch this Scientific Journal Video about Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy at JoVE.com

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Deze video artikel beschrijft de experimentele procedure voor het verkrijgen van de Gibbs vrije energie van membraaneiwit vouwen door tryptofaan fluorescentie.

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Bioengineering

Thermodynamics

SCIENTISTS IN ACTION

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Microfluïdische Mixers voor het bestuderen van eiwitten vouwen

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Een stap verder BRET: Fluorescentie door geconsolideerd Opwinding van luminescentie (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Bereiding van extracellulaire matrix eiwit vezels voor Brillouin Spectroscopie

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...