Name: lineage labeling of zebrafish cells with laser uncagable fluorescein dextran
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran at JoVE.com

ברצוננו להודות דן קרלין לעזרה בקבלת והעמסת בכלוב. בנוסף אנו רוצים להודות מקורות המימון הבאים: אוניברסיטת ונדרבילט תוכנית בית הספר לרפואה של גרנט לביולוגיה התפתחותית הכשרת הומ&quot;ת, ו-NIH HD054534to JTG.

1. סינתזה של Caged והעמסת dextran <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את 3.5-4 מ&quot;ג aminodextran ולהוסיף לתוך צינור Invitrogen-סיפקה כהים המכיל 1 מ&quot;ג של CMNB-בכלוב והעמסת SE. בידיים שלנו יחס זה נותן טעינה ממוצע של 2.5 ~ מולקולות צבע לכל dextran. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספ...

<ol>
	<li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo.">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina.">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li><li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages.">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , 1-8 (1991).</li><li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system.">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuC:Kaede,+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo.">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).</li><li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein.">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li><li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+(caged)+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo.">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li><li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon.">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li><li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo,+Lytechinus+variegatus,+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry.">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li></ol>

כפי שתואר, פרוטוקול זה מספק תיוג מהיר יחסית השושלת דג הזברה השיטה בנויה על טכניקות נפוץ של microinjection, מיקרוסקופיה, ו immunofluorescence. מצאנו כי הלייזר משחררות רפרוף להיות הדרך היעילה יעיל ביותר עלות uncage והעמסת באופן מקומי. שיטה זו יכולה לשמש תווית השושלת עם נקודות הקצה ניסיונ?...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CMNB-caged fluorescein SE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C20050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aminodextran, 10kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeba desalt spin columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>89889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>goat anti-fluorescein antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A11095</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A21082</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mmx10mm petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Upright compound microscope with 40x water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DM6000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MicroPoint Manual Laser Illumination System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Photonic Instruments</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenylthiourea (PTU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alfa Aesar</td>
<td>L06690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E10521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>03115836991</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic thread</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any sewing supply store</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Products International</td>
<td>A20090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpeedVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>Savant SPD131DDA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortexing mixer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Vortex Genie 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pressure injector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
<td>MPPI-3</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

lineage labeling of zebrafish cells with laser uncagable fluorescein dextran

הבעיה המרכזית בביולוגיה התפתחותית היא להסיק את מקורם של סוגי התאים הרבים המצויים חוליות כפי שהם נובעים מבשרי מובחן. חוקרים בשיטות שונות של תיוג השושלת, כגון תיוג DiI 1 ו הזרקה בלחץ של אנזימים למעקב 2 לגורל התא לברר בשלבים מאוחרים יותר של ההתפתחות במערכות מודל. מפות גורל הראשון דג הזברה (Danio rerio) הורכבו על ידי הזרקת iontophoretic של צבעי ניאון, כגון rhodamine dextran, לתוך תאים בודדים באזורים נפרדים של העובר וכן מעקב גורל התא מסומן לאורך זמן 3-5. בעוד יעיל, שיטות אלו תובענית מבחינה טכנית דורשים ציוד מיוחד ולא נפוץ למצוא דג הזברה מעבדות. לאחרונה, חלבוני ניאון photoconvertable, כגון Eos ו קאךה, אשר באופן בלתי הפיך לעבור מירוק פלואורסצנטי אדום בעת חשיפה לאור אולטרה סגול, רואים שימוש מוגבר דג הזברה 6-8. בהירות אופטית של העובר דג הזברה ואת הקלות היחסית של transgenesis הפכו כלים אלה אטרקטיבי במיוחד עבור תיוג השושלת כדי לבחון את ההגירה של תאים in vivo 7. למרות השירות שלהם, חלבונים אלה יש כמה חסרונות לעומת לצבוע בתיווך שיטות תיוג השושלת. החשוב ביותר הוא הקושי שמצאנו בהשגת ברזולוציה גבוהה 3-D במהלך photoconversion של החלבונים האלה. לאור זאת, אולי את השילוב הטוב ביותר של ההחלטה וקלות השימוש עבור תיוג השושלת של דג הזברה עושה שימוש בכלוב והעמסת dextran, צבע פלואורסצנטי כי הוא מחויב לקבוצה מרווה כי מסכות 9 הקרינה שלה. לצבוע אז יכול להיות &quot;שברחה מכלוב&quot; (שוחרר מהקבוצה מרווה) בתוך תא ספציפי באמצעות אור UV ממנורת לייזר או כספית, המאפשר ויזואליזציה של הקרינה שלה או immunodetection. שלא כמו שיטות iontophoretic, והעמסת בכלוב ניתן להזריק עם מנגנוני זריקה סטנדרטיים שברחה מכלוב עם מיקרוסקופ epifluorescence מצויד חריר 10. בנוסף, נוגדנים נגד והעמסת לזהות רק את הטופס שברחה מכלוב, ו epitope שורד קיבעון גם 11. לבסוף, והעמסת בכלוב יכול להיות מופעל עם רזולוציה של 3-D גבוהות מאוד, במיוחד אם מיקרוסקופיה שני הפוטונים מועסק 12,13. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיוג השושלת על ידי והעמסת בכלוב משחררות רפרוף לייזר. Subsequenctly, שברחה מכלוב והעמסת מזוהה בו זמנית על ידי סימון עם נוגדנים עם epitopes אחרים, כגון ה-GFP.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran at JoVE.com

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

פרוטוקול זה מתווה דרך התווית להתחקות אחר גורלו של קבוצות קטנות של דג הזברה עוברים התאים באמצעות UV-משחררות רפרוף של והעמסת בכלוב, ואחריו הר שלם immunolabeling כדי להגביר את האות והעמסת את שברחה מכלוב.

Lineage תיוג של תאים דג הזברה עם לייזר Uncagable והעמסת dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

הדמיה Glycans בעוברים דג הזברה על ידי תיוג מטבולית וכימיה לחץ Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

ויזואליזציה, כימות פוטנציאל בידול Adipogenic תא Mesenchymal עם סמן ספציפי שושלת היוחסין

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

איתור השושלת וניתוח שבטים בפיתוח קליפת המוח באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...