Name: dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Wij danken dr. Nael Alami en Dr Nam Chul Kim voor hun nuttige opmerkingen over dit manuscript.

1. Voorbereiding voor immunofluorescentie: <ol><li> Voor het maken van een dissectie oppervlak, giet Sylgard 184 Siliconen Elastomeren Base in een kleine weefselkweek plaat. Zorg ervoor dat niet op de plaat te vullen volledig, zodat de dissectie gebied lager is dan de velg. </li><li> Trim dissectie pinnen tot een lengte van ongeveer 3,5 mm voor meer gemak van manipulatie, en zorg ervoor dat ten minste 6-pins per larve hebben. </li><li> U moet stompe tang waarmee u begrijpen de pinnen voor de dissectie. </li></ol><p cl...

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Voor neuronen, de synaptische terminal gebied is van cruciaal belang, en is de brug voor een goede communicatie tussen de post-en pre-synaptische cellen. Een krachtige manier om de gezondheid van het neuron te onderzoeken bij de ziekte van modellen is aan eiwitten van de synaptische terminal te analyseren door immunofluorescentie. De immunofluorescentie methode hier gepresenteerde Hiermee kan de onderzoeker een groot aantal larven tegelijk onderzoeken, terwijl het beperken van de ecologische verschillen tussen de groepe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus Nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silicone elastomeer Base </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Na het mengen zorgen voor luchtbellen te langzaam uit stijgen door het aantrekken van langzame rotator of toestaan ​​te zitten voor 30 minuten of meer. </td></tr><tr><td> Stainless Steel Minutien Pins </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td> Trim tot ca.. 3-4mm in lengte met gewone schaar </td></tr><tr><td> Laminectomie pincet (Blunt-Gebruikt voor grijpen pinnen) </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11223-20 </td><td> Gebruik als botte tangen voor het grijpen pinnen </td></tr><tr><td> Dissection Forceps </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Superfijn Vannas Schaar, 8cm lang </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Muis anti-Brp antilichaam </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Gebruik 1:50 verdunning </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure geit anti-mierikswortelperoxidase </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Gebruik bij 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Gebruik ca.. 1:200 verdunning </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

De Drosophila larven neuromusculaire junctie (NMJ) is een uitstekend model voor de studie van synaptische structuur en functie. Drosophila staat bekend om het gemak van krachtige genetische manipulaties en het larvale zenuwstelsel heeft bewezen vooral nuttig bij het ​​bestuderen van niet alleen de normale functie, maar ook storingen die gepaard gaan met een aantal neurologische aandoeningen (Lloyd en Taylor, 2010). Veel belangrijke synaptische moleculen gevonden in Drosophila zijn ook gevonden in zoogdieren en zoals de meeste CNS synapsen excitatoire in zoogdieren, de Drosophila NMJ is glutamaat en vertoont ook een activiteit-afhankelijke remodeling (Koh et al.., 2000). Bovendien kan Drosophila neuronen worden individueel geïdentificeerd omdat hun innervatie patronen stereotiepe en zich herhalende waardoor het mogelijk is om de vastgestelde synaptische terminals, zoals die tussen neuronen en het lichaam-muur spiervezels dat ze innerveren (Keshishian en Kim, 2004). Bestuderen Het bestaan ​​van evolutionair geconserveerd synaps componenten, samen met het gemak van genetische en fysieke manipulatie maken het Drosophila model ideaal is voor het onderzoek naar de onderliggende mechanismen van synaptische functie (Budnik, 1996). De actieve zones op synaptische terminals zijn van bijzonder belang, omdat deze zijn de sites van neurotransmitters. NC82 is een monoklonaal antilichaam dat het Drosophila-eiwit Bruchpilot (BRP), een CAST1/ERC familielid, dat is een belangrijk onderdeel van de actieve zone (Wagh et al., 2006). Herkent. BRP bleek direct de vorm van de actieve zone T-bar en is verantwoordelijk voor het effectief clustering Ca 2 +-kanalen onder de T-bar dichtheid (Fouquet et al.., 2009). Mutanten van Brp zijn verminderd Ca 2 + kanaal dichtheid, depressief opgeroepen blaasje release, en veranderde op korte termijn plasticiteit (Kittel et al., 2006).. Wijzigingen in actieve zones zijn waargenomen in Drosophila ziekte modellen. Bijvoorbeeld, immunofluorescentie met behulp van de NC82 antilichaam bleek dat de actieve zone dichtheid was afgenomen in modellen van amyotrofe laterale sclerose en Pitt Hopkins-syndroom (Ratnaparkhi et al., 2008;. Zweier et al., 2009.). Zo kan de evaluatie van actieve zones, of andere synaptische proteïnen, in Drosophila larven van de ziekte van een waardevolle eerste aanwijzing voor de aanwezigheid van een synaptische defect. Voorbereiden hele-mount ontleed Drosophila larven voor immunofluorescentie analyse van de NMJ vereist enige vaardigheid, maar kan worden bereikt door de meeste wetenschappers met een beetje oefening. Gepresenteerd, is een methode die zorgt voor meerdere larven worden ontleed en immunostained in dezelfde dissectie gerecht, het beperken van het milieu de verschillen tussen elk genotype en zorgen voor voldoende dieren voor vertrouwen in de reproduceerbaarheid en statistische analyse.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

De neuromusculaire junctie (NMJ) van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Is een belangrijk model voor het bestuderen van een normale synaptische functie en storingen aan synaptische functie vinden in bepaalde neurologische aandoeningen. We presenteren een protocol voor dissectie van de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale motoriek en immunokleuring voor actieve zone eiwitten binnen de NMJ.

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection en Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detectie van<em&gt; In Situ</em&gt; Eiwit-eiwit complexen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Twee algoritmes voor High-throughput en multi-parametrische Kwantificering van<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromusculaire Junction morfologie

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...