Name: dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Nous remercions le Dr Nael Alami et le Dr Nam Chul Kim pour leurs précieux commentaires sur ce manuscrit.

1. Préparation pour immunofluorescence: <ol><li> Pour créer une surface de dissection, versez Sylgard 184 base élastomère de silicone dans une plaque de culture de tissus de petite taille. Assurez-vous de ne pas remplir complètement la plaque afin que la zone de dissection est inférieure à la jante. </li><li> Garniture broches de dissection d&#39;une longueur d&#39;environ 3,5 mm pour une plus grande facilité de manipulation, et assurez-vous d&#39;avoir au moins 6 broches par larve. </li><li> Vous aurez besoin...

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Pour les neurones, la zone du terminal synaptique est d&#39;une importance cruciale, et il est le pont pour une bonne communication entre les post-et pré-synaptique des cellules. Un moyen puissant pour étudier la santé des neurones dans des modèles de la maladie est d&#39;analyser les protéines du terminal synaptique par immunofluorescence. La méthode d&#39;immunofluorescence présenté ici permet au chercheur d&#39;examiner de nombreuses larves simultanément tout en limitant les différences entre les groupes en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Sylgard 184 base élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Après le mélange permettent de bulles d&#39;augmenter lentement en mettant sur des rotateurs lents ou permettant de s&#39;asseoir pendant 30 minutes ou plus. </td></tr><tr><td> Acier inoxydable Pins Minutien </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Garniture à env. 3-4mm de long avec des ciseaux ordinaires </td></tr><tr><td> Pince Laminectomie (Blunt-Utilisé pour saisir broches) </td><td> Outils de Fine Science </td><td> 11223-20 </td><td> Utilisez-le comme une pince émoussée pour saisir broches </td></tr><tr><td> Pinces à dissection </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas SuperFine Ciseaux, 8cm de long </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> De souris anti-BRP d&#39;anticorps </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Utilisez dilution 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 chèvre AffiniPure anti-peroxydase de raifort </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Utilisez au 1:200 dilution </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Utilisez environ. 1:200 dilution </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

La drosophile larves jonction neuromusculaire (JNM) est un excellent modèle pour l&#39;étude de la structure synaptique et la fonction. Drosophile est bien connue pour la facilité de puissantes manipulations génétiques et le système nerveux des larves s&#39;est révélée particulièrement utile pour étudier non seulement la fonction normale, mais aussi des perturbations qui accompagnent certaines maladies neurologiques (Lloyd et Taylor, 2010). Bon nombre des principaux molécules synaptiques trouvés chez la drosophile sont également présents chez les mammifères et comme la plupart des synapses excitatrices du système nerveux central chez les mammifères, la drosophile est JNM glutamatergique et démontre dépendant de l&#39;activité de remodelage (Koh et al., 2000). En outre, les neurones de drosophile peuvent être identifiés individuellement, car leurs habitudes innervation sont stéréotypés et répétitifs permettant d&#39;étude a identifié terminaisons synaptiques, telles que celles entre les motoneurones et les fibres musculaires du corps-mur qu&#39;ils innervent (Keshishian et Kim, 2004). L&#39;existence de composants synapse évolutivement conservés avec la facilité de la manipulation génétique et physique rendre le modèle idéal pour étudier la drosophile mécanismes sous-jacents de la fonction synaptique (Budnik, 1996). Les zones actives à terminaisons synaptiques sont d&#39;un intérêt particulier parce que ce sont les sites de la libération des neurotransmetteurs. NC82 est un anticorps monoclonal qui reconnaît la drosophile la protéine Bruchpilot (BRP), une membre de la famille CAST1/ERC qui est un élément important de la zone active (Wagh et al., 2006). BRP a montré d&#39;adapter directement la zone active T-bar et est responsable de regroupement efficace canaux Ca 2 + sous la barre en T de densité (Fouquet et al., 2009). Mutants de BRP ont réduit de Ca 2 + densité de canaux, déprimé communiqué vésicules évoqués, et modifié à court terme de plasticité (Kittel et al., 2006). Modifications aux zones actives ont été observées dans les modèles de la maladie chez la drosophile. Par exemple, l&#39;immunofluorescence utilisant l&#39;anticorps NC82 a montré que la densité de la zone active a diminué dans les modèles de la sclérose latérale amyotrophique et Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Ainsi, l&#39;évaluation des zones actives, ou d&#39;autres protéines synaptiques, dans les modèles de larves de drosophile de la maladie peut fournir un indice précieux initiale à la présence d&#39;un défaut synaptique. Préparer l&#39;ensemble de montage des larves de drosophile disséquées pour l&#39;analyse par immunofluorescence de l&#39;JNM exige une certaine habileté, mais qui peut être accompli par la plupart des scientifiques avec un peu de pratique. Présenté est une méthode qui permet aux larves de plusieurs à être disséqués et immunocolorés dans le plat même dissection, limitant les différences environnementales entre chaque génotype et en fournissant suffisamment d&#39;animaux pour la confiance dans la reproductibilité et l&#39;analyse statistique.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

La jonction neuromusculaire (JNM) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Est un système modèle important pour étudier la fonction synaptique normale ainsi que des perturbations de la fonction synaptique dans certaines maladies neurologiques. Nous présentons un protocole de dissection de la<em&gt; Drosophile</em&gt; Larvaires système de moteur et immunocoloration des protéines zone active au sein du MNJ.

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Recherche

Neurosciences

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Deux algorithmes pour Quantification haut débit et multi-paramétrique de<em&gt; drosophile</em&gt; Junction neuromusculaires Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...