Name: dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Nael Alami e Dr. Chul Kim Nam por seus comentários sobre este manuscrito.

1. Preparação para Imunofluorescência: <ol><li> Para criar uma superfície de dissecação, despeje Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone em uma pequena placa de cultura de tecidos. Certifique-se de não encher o prato completamente para que a área de dissecção é menor do que o aro. </li><li> Guarnição pinos de dissecação para um comprimento de cerca de 3,5 mm para maior facilidade de manipulação, e certifique-se de ter pelo menos 6 pinos por larva. </li><li> Você vai precisar de uma pinç...

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

Para os neurônios, a área terminal sináptico é de fundamental importância, e é a ponte para a comunicação adequada entre o pós e pré-sináptica células. Uma forma poderosa para investigar a saúde do neurônio em modelos de doença é analisar proteínas do terminal sináptico por imunofluorescência. O método de imunofluorescência apresentado aqui permite que o pesquisador examine muitas larvas simultaneamente, limitar as diferenças ambientais entre os grupos. O sistema nervoso central de Drosophila</...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Após a mistura permitir bolhas a subir lentamente para fora, colocando em rotator lenta ou permita a sentar-se por 30 minutos ou mais. </td></tr><tr><td> Aço Inoxidável PINs Minutien </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 26002-10 </td><td> Guarnição para aprox. 3-4mm de comprimento, com tesouras regulares </td></tr><tr><td> Pinça laminectomia (Blunt-Usado para agarrar pinos) </td><td> Multa ferramentas da Ciência </td><td> 11223-20 </td><td> Use como uma pinça para agarrar blunt pinos </td></tr><tr><td> Pinça dissecção </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501985 </td><td></td></tr><tr><td> SuperFine Tesoura Vannas, 8cm longo </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Rato de anticorpos anti-Brp </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Use diluição 1:50 </td></tr><tr><td> Cy3 Goat Affinipure Peroxidase Anti-rábano </td><td> Immunoresearch Jackson </td><td> 123-165-021 </td><td> Use a diluição de 1:200 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 cabra anti-camundongo IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Use aprox. Diluição de 1:200 </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

As larvas Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é um excelente modelo para o estudo da estrutura e função sináptica. Drosophila é bem conhecida pela facilidade de poderosas manipulações genéticas e do sistema nervoso das larvas tem-se revelado particularmente útil no estudo não só a função normal, mas também perturbações que acompanham algumas doenças neurológicas (Lloyd e Taylor, 2010). Muitos dos principais moléculas synaptic encontrados em Drosophila também são encontrados em mamíferos e como a maioria das sinapses excitatórias do SNC em mamíferos, o MNJ Drosophila é glutamatérgica e demonstra dependente de atividade de remodelação (Koh et al., 2000). Além disso, os neurônios Drosophila pode ser identificados individualmente, porque os seus padrões de inervação são estereotipados e repetitivos tornando possível estudo identificou terminais sinápticos, como aquelas entre neurônios motores e as fibras do corpo na parede muscular que eles inervam (Keshishian e Kim, 2004). A existência de componentes sinapse evolutivamente conservadas junto com a facilidade de manipulação genética e física tornar o modelo Drosophila ideal para investigar os mecanismos subjacentes função sináptica (Budnik, 1996). As zonas de ativos nos terminais sinápticos são de particular interesse porque estes são os locais de liberação do neurotransmissor. NC82 é um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína Drosophila Bruchpilot (BRP), um membro da família CAST1/ERC que é um componente importante da zona ativa (Wagh et al., 2006). Brp foi mostrado diretamente moldam a zona ativa T-bar e é responsável por efetivamente agrupamento Ca 2 + canais abaixo da densidade de T-bar (Fouquet et al., 2009). Mutantes de Brp reduziram Ca 2 + densidade de canais, a liberação da vesícula deprimido evocada, e plasticidade de curto prazo alterados (Kittel et al., 2006). Alterações às zonas ativas têm sido observadas em modelos de doenças Drosophila. Por exemplo, imunofluorescência usando o anticorpo NC82 mostrou que a densidade zona ativa foi diminuída em modelos de esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Assim, a avaliação das zonas de ativo, ou de outras proteínas sinápticas, em modelos de larvas de Drosophila da doença pode fornecer uma pista valiosa inicial para a presença de um defeito sináptico. Preparar toda montagem dissecados larvas Drosophila para análise de imunofluorescência do MNJ requer alguma habilidade, mas pode ser realizado pela maioria dos cientistas com um pouco de prática. Apresentada é um método que fornece para as larvas múltiplos a ser dissecados e imunocoradas no prato dissecção mesmo, limitando as diferenças ambientais entre cada genótipo e fornecer animais suficiente para a confiança na reprodutibilidade e análise estatística.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

A junção neuromuscular (MNJ) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; É um sistema modelo importante para o estudo da função sináptica normal, assim como perturbações de função sináptica encontrada em certas doenças neurológicas. Nós apresentamos um protocolo para a dissecção da<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval sistema motor e imunomarcação de proteínas zona ativa dentro do MNJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Único Drosophila Dissection omatídeo e Imagem

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Neurociência

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detecção de<em&gt; In Situ</em&gt; Complexos proteína-proteína no<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

A Junção Neuromuscular: Synapse Medir o tamanho, Mudanças de fragmentação e em Synaptic Density proteína utilizando microscopia de fluorescência confocal

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dois Algoritmos para métodos de alta capacidade e Multi-paramétrico Quantificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção Neuromuscular Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...