Name: dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction
Uploaded: 2011-04-27T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Vi tackar Dr Nael Alami och Dr Nam Chul Kim för deras hjälpsamma kommentarer om detta manuskript.

1. Förberedelse för Immunfluorescens: <ol><li> För att skapa en dissekera yta, häll Sylgard 184 Base Silicone Elastomer i en liten vävnadskultur plattan. Se till att inte fylla tallriken helt så att dissektion området är lägre än fälgen. </li><li> Trimma dissektion stift till en längd av ca 3,5 mm för ökad enkel manipulation, och se till att ha minst 6 stift per larv. </li><li> Du behöver trubbig pincett som gör att man håller om stiften för dissekering. </li></ol> 2. Dissektion...

<ol>
	<li>Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+maturation+and+structural+plasticity+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions.</a> Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).</li><li>Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot.">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).</li><li>Hoang, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Drosophila+Larval+Neuromuscular+Synapses.">Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses.</a> Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).</li><li>Keshishian, H., Kim, Y. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+development+and+function:+retrograde+BMP+signaling+in+the+Drosophila+nervous+system.">Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system.</a> Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).</li><li>Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot+Promotes+Active+Zone+Assembly,+Ca2++Channel+Clustering,+and+Vesicle+Release.">Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release.</a> Science. 312, 1051-1054 (2006).</li><li>Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+neuromuscular+junction:+Molecular+components+and+mechanisms+underlying+synaptic+plasticity.">Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity.</a> Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+ALS:+human+ALS-associated+mutation+in+VAP33A+suggests+a+dominant+negative+mechanism.">A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism.</a> PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).</li><li>Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., D&#252;rrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruchpilot,+a+Protein+with+Homology+to+ELKS/CAST,+Is+Required+for+Structural+Integrity+and+Function+of+Synaptic+Active+Zones+in+Drosophila.">Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila.</a> Neuron. 49, 833-844 (2006).</li><li>Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTNAP2+and+NRXN1+are+mutated+in+autosomal-recessive+Pitt-Hopkins-like+mental+retardation+and+determine+the+level+of+a+common+synaptic+protein+in+Drosophila.">CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila.</a> Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).</li></ol>

För nervceller, är det synaptiska terminalområdet av avgörande betydelse, och är bron för korrekt kommunikation mellan post-och pre-synaptisk celler. Ett kraftfullt sätt att undersöka hälsan hos neuron i sjukdomen modellerna är att analysera proteiner från synaptiska terminalen med immunofluorescens. Den immunofluorescens metod som presenteras här ger forskaren att undersöka många larver samtidigt samtidigt begränsa de miljömässiga skillnader mellan grupper. Det centrala nervsystemet hos Drosophila<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på Reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silicone Elastomer Base </td><td> Dow Corning </td><td> 68037-59-2 </td><td> Efter blandning tillåter bubblor stiga långsamt ut genom att sätta på långsam rotator eller låta sitta i 30 minuter eller mer. </td></tr><tr><td> Rostfritt stål Minutien Pins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-10 </td><td> Klipp till ca. 3-4mm i längd med vanlig sax </td></tr><tr><td> Laminektomi Tång (Blunt-Används för att greppa stift) </td><td> Fine Science verktyg </td><td> 11.223-20 </td><td> Använd som trubbig pincett för att ta tag stift </td></tr><tr><td> Dissection Tång </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 501.985 </td><td></td></tr><tr><td> Superfin Vannas Saxar, 8cm lång </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 501.778 </td><td></td></tr><tr><td> Mus-anti-BRP antikropp </td><td> DSHB </td><td> NC82 </td><td> Använd 1:50 utspädning </td></tr><tr><td> Cy3 Affinipure get-anti-pepparrotsperoxidas </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 123-165-021 </td><td> Använd vid 1:200 spädning </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG </td><td> Invitrogen </td><td> A11001 </td><td> Använd ca. 1:200 utspädning </td></tr></tbody></table>

dissection and imaging of active zones in the drosophila neuromuscular junction

Den Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en utmärkt modell för studier av synaptiska struktur och funktion. Drosophila är välkänd för hur lätt av kraftfulla genetiska manipulationer och larver nervsystemet har visat sig särskilt användbara för att studera inte bara normal funktion, men också störningar som följer med en del neurologiska sjukdomar (Lloyd och Taylor, 2010). Många viktiga synaptiska molekyler som finns i Drosophila finns också hos däggdjur och som de flesta CNS retande synapser i däggdjur, är Drosophila NMJ glutamaterg och visar aktivitet beroende ombyggnad (Koh et al., 2000). Dessutom kan Drosophila nervceller kan identifieras eftersom deras innervation mönster är stereotypa och repetitiva vilket gör det möjligt att studera identifierats synaptiska terminaler, till exempel mellan motoriska nervceller och kroppen vägg muskelfibrer att de innerverar (Keshishian och Kim, 2004). Förekomsten av evolutionärt bevarat synaps komponenter tillsammans med enkel genetisk och fysisk manipulation gör Drosophila modell idealisk för att undersöka mekanismerna bakom synaptiska funktion (Budnik, 1996). Den aktiva zoner på synaptiska terminaler är av särskilt intresse eftersom dessa är områden av signalsubstansen release. NC82 är en monoklonal antikropp som erkänner Drosophila proteinet Bruchpilot (BRP), en CAST1/ERC familjemedlem som är en viktig del av den aktiva zonen (Wagh et al., 2006). BRP visades direkt forma den aktiva zonen T-bar och är ansvarig för att effektivt klustring Ca 2 +-kanaler under T-stången densitet (Fouquet et al., 2009). Mutanter av BRP har minskat Ca 2 +-kanal densitet, deprimerad framkallade vesikler release, och förändrade kortsiktiga plasticitet (Kittel et al., 2006). Ändringar aktiva zoner har observerats hos Drosophila sjukdom modeller. Till exempel visade immunofluorescens med NC82 antikropp som den aktiva zonen tätheten sänktes i modeller av amyotrofisk lateralskleros och Pitt-Hopkins syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Således kan bedömningen av aktiva zoner eller andra synaptiska proteiner i Drosophila larver modeller av sjukdomen ett värdefullt första ledtråd till förekomsten av en synaptisk defekt. Förbereda hela montering dissekeras Drosophila larver för immunofluorescens analys av NMJ kräver en del skicklighet, men kan uppnås genom att de flesta forskare med lite övning. Presenteras är en metod som möjliggör flera larver som skall dissekeras och immunostained i samma dissektion maträtt, vilket begränsar miljömässiga skillnader mellan varje genotyp och ger tillräcklig djur för förtroendet reproducerbarhet och statistisk analys.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction at JoVE.com

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Är ett viktigt modellsystem för att studera normal synaptisk funktion samt störningar för att synapserna finns i vissa neurologiska sjukdomar. Vi presenterar ett protokoll för dissekering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver motoriska system och immunfärgning för aktiv zon proteiner inom NMJ.

Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

Singel Drosophila Ommatidium Dissection och Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissekering av Transversus Abdominis muskel för hela berget Neuromuskulär junction analys

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion av<em&gt; In situ</em&gt; Protein-proteinkomplex på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mäta neuromuskulära förbindelsen funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Två algoritmer för hög kapacitet och Multi-parametrisk Kvantifiering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskulära förbindelsen Morfologi

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch inspelningar av Synaptic strömmar från den Drosophila Larval neuromuskulära förbindelsen

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...