Name: transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

De pCAG-gapEGFP plasmide was een geschenk van dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide was een geschenk van dr. M. Feller (Berkeley, CA). Wij danken dr. Edward Ruthazer voor het suggereren het gebruik van een twee-plasmide strategie voor enkele cel etikettering en Anne Schohl (Montreal, QC) voor de validatie van de twee-plasmide Cre / loxP strategie in pilot-studies en Crair lab leden voor technische ondersteuning. Ondersteund door R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) en NIH P30 EY000785 (MC).

1. Apparatuur Set-up voor Elektroporatie <ol><li> Elektroden: We gewijzigd Dumont # 5 tang te gebruiken als elektroden. <ol><li> Scheiden en splitsen de tang. </li><li> Soldeer een draad aan het bredere eind van elk uitsteeksel. Wikkel de draad aangesloten en tanden met isolatietape het verlaten van ongeveer 25-30 mm van de tip van de blootgestelde de tanden. </li><li> Leg de gewijzigde pincet terug, samen met een geschikte plastic spacer (bijvoorbeeld een knop) tussen de twee tanden aan veerwerking te bieden...

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

In deze video zien we een in vivo electroporatie protocol dat resulteert in de etikettering van enkele of kleine clusters van retinale neuronen in postnatale muizen met DNA-constructen die coderen voor fluorescerende eiwitten. Kleine clusters van fluorescent gelabelde RGC projecties naar de dLGN en SC gereproduceerd soortgelijke projectie patronen als eerdere studies met behulp van RGC etikettering met lipofiele kleurstoffen, wat aangeeft dat elektroporatie niet interfereren met de normale RGC axon prieel verfi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materialen </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogusnummer </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Forceps </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Elektrische Stimulator </td><td> Gras Instrumenten </td><td> Model S4 </td></tr><tr><td> Oscilloscoop </td><td> Agilent </td><td> Model 54621A </td></tr><tr><td> Audio-monitor </td><td> Gras Instrumenten </td><td> Model AM8B </td></tr><tr><td> Puller </td><td> Sutter Instrumenten </td><td> Model P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Schaar een </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Schaar b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Forceps c </td><td> Fijn Science Tools </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II System </td><td> Drummond Wetenschappelijke </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Glazen pipetten </td><td> Drummond Wetenschappelijke </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Voetpedaal </td><td> Drummond Wetenschappelijke </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Mineral Oil </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> Dii </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-dimethylformamide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

De doelgerichtheid en verfijning van RGC projecties naar de middenhersenen is een populaire en krachtige modelsysteem voor het bestuderen van hoe nauwkeurig patronen van neurale verbindingen vormen tijdens de ontwikkeling. Bij muizen zijn retinofugal projecties gerangschikt in een topografische wijze en vorm eye-specifieke lagen in de laterale geniculate Nucleus (dLGN) van de thalamus en de Superior colliculus (SC). De ontwikkeling van deze precieze patronen van retinofugal projecties heeft meestal onderzocht door middel van etikettering populaties van RGC met fluorescerende kleurstoffen en tracers, zoals mierikswortelperoxidase 1-4. Maar deze methoden zijn te grof om inzicht te krijgen in de ontwikkeling veranderingen in de individuele RGC axonale prieel morfologie, die de basis van retinotopische kaart formatie. Ze hebben ook niet mogelijk voor de genetische manipulatie van RGC. Onlangs is elektroporatie uitgegroeid tot een effectieve methode voor het verstrekken van nauwkeurige ruimtelijke en temporele controle voor de levering van geladen moleculen in het netvlies 5-11. Huidige netvlies elektroporatie protocollen niet mogelijk voor genetische manipulatie en het traceren van retinofugal projecties van een enkele of een kleine cluster van RGC in postnatale muizen. Er is betoogd dat postnatale in vivo elektroporatie niet is een levensvatbare methode voor transfecteren RGC, omdat de etikettering rendement is extreem laag en eist daarom dat gericht op embryonale leeftijd bij RGC voorouders zijn differentiatie en proliferatie 6 ondergaan. In deze video beschrijven we een in vivo electroporatie protocol voor gerichte toediening van genen, shRNA, en fluorescerende dextranen voor muriene RGC postnataal. Deze techniek biedt een rendabele, snelle en relatief makkelijk platform voor een efficiënte screening van kandidaat-genen die betrokken zijn bij verschillende aspecten van neurale ontwikkeling, met inbegrip axon retractie, vertakking, lamineren, regeneratie en synapsvorming in verschillende stadia van ontwikkeling circuit. In het kort beschrijven we hier een waardevol hulpmiddel die verder inzicht verschaft in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen zintuiglijke kaart ontwikkeling.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Demonstreren we een<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporatie protocol voor transfecteren enkele of kleine clusters van retinale ganglioncellen (RGC) en andere retinale celtypes in postnatale muizen over een breed scala aan leeftijden. De mogelijkheid om label en genetisch te manipuleren postnatale RGC<em&gt; In vivo</em&gt; Is een krachtig hulpmiddel voor ontwikkelings-studies.

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Uitvoering Dynamic Klem met Synaptic en kunstmatige geleidingen Mouse in retinale ganglioncellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In vivo genoverdracht naar Schwann cellen in het knaagdier heupzenuw door elektroporatie

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optische coherentie tomografie: Beeldvorming muis retinale Ganglion cellen In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Behandelende zoogdieren Axon regeneratie: In Vivo Electroporation van volwassen muis achterwortelganglia Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...