Name: transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

PCAG-gapEGFP плазмиду подарок от д-р С. Макконнелл (Стэнфорд, Калифорния). pCAG-tdTomato плазмиду подарок от д-ра М. Феллер (Беркли, Калифорния). Мы благодарим д-р Эдвард Ruthazer за предложение использование двух плазмид стратегии для одной маркировки клеток и Энн Schohl (Montreal, QC) для проверки двух плазмид Cre / loxP стратегии в экспериментальных исследованиях и членов Crair лабораторию для технической поддержки. Поддержка R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) и NIH P30 EY000785 (МК).

1. Подключение оборудования для Электропорация <ol><li> Электроды: Мы изменили Дюмон # 5 щипцы для использования в качестве электродов. <ol><li> Отдельные и развалится щипцами. </li><li> Паяльной проволоки на широкий конец каждого зубца. Оберните провод прилагается и зубцами изоляционной лен...

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

В этом видео мы демонстрируем в протокол электропорации естественных условиях, что приводит к маркировке одного или небольших групп нейронов сетчатки в постнатальном мышей с ДНК-конструкции кодирования флуоресцентных белков. Малые кластеры флуоресцентно меченных РГК прое?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Материалы </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> Дюмон # 5 Пинцет </td><td> Инструменты изобразительных наук </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Электростимуляторы </td><td> Трава инструменты </td><td> Модель S4 </td></tr><tr><td> Осциллограф </td><td> Agilent </td><td> Модель 54621A </td></tr><tr><td> Аудио монитор </td><td> Трава инструменты </td><td> Модель AM8B </td></tr><tr><td> Съемник </td><td> Саттер инструменты </td><td> Модель P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Ножницы </td><td> Инструменты Всемирного Precision </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Ножницы б </td><td> Тед Пелла </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Дюмон А. А. Пинцет с </td><td> Инструменты изобразительных наук </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II системы </td><td> Драммонд Научные </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Стекло Пипетки </td><td> Драммонд Научные </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Педаль </td><td> Драммонд Научные </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Минеральное масло </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-диметилформамид </td><td> Сигма </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

Адресности и уточнение РГК проекции среднего мозга является популярным и мощным модельной системы для изучения того, как точной модели нейронной форма связи в процессе разработки. У мышей, retinofugal прогнозы расположены в топографических порядке и по форме глаз конкретных слоев наружного коленчатого тела (dLGN) таламуса и верхний бугорок (SC). Развитие этих точных моделей retinofugal прогнозы как правило, были изучены маркировки популяций РГК с флуоресцентными красителями и индикаторов, таких, как пероксидаза хрена 1-4. Однако, эти методы слишком грубы, чтобы дать представление о развитии изменений в отдельные РГК аксонального морфологии беседки, которые являются основой retinotopic формирование карты. Они также не позволяют генетические манипуляции РГК. В последнее время электропорации стала эффективным методом для обеспечения точной пространственной и временной контроль на поставку заряженных молекул в сетчатку 5-11. Текущий сетчатки протоколов электропорации не позволяют генетических манипуляций и отслеживание retinofugal проекции одного или небольшой кластер РГК в постнатальном мышей. Утверждалось, что в послеродовом электропорации естественных условиях не является жизнеспособным методом трансфекции РГК с маркировки эффективность крайне мала и, следовательно, требует ориентации на эмбриональном возрасте, когда RGC прародителей проходят дифференциации и пролиферации 6. В этом видео мы описываем в естественных условиях электропорации протокол для адресной доставки генов, shRNA и флуоресцентные декстраны с мышиным РГК постнатально. Эта техника представляет собой экономически эффективный, быстрый и относительно легко платформу для эффективного скрининга генов-кандидатов, участвующих в нескольких аспектах развития нервной системы, включая аксон опровержение, ветвящийся, ламинирование, регенерацию и формирование синапса на различных этапах схемы развития. В заключение мы описываем здесь ценным инструментом, который обеспечит более полное представление о молекулярных механизмах основной сенсорное развитие карте.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Мы демонстрируем<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Электропорации протокол для трансфекции одного или небольших групп ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и другие типы клеток сетчатки в постнатальном мышей в широком диапазоне возрастов. Возможность маркировать и генетически манипулировать послеродовой РГК<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Является мощным инструментом для развития исследований.

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Мышь В утробе матери Электропорация: Пространственно-временные Контролируемые трансфекции генов

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по<em&gt; В Vivo</em&gt; Электропорация

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Реализация динамического Хомут с Synaptic и искусственного проводимости в мыши ганглиозных клеток сетчатки

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Ретроградная Маркировка ганглиозных клеток сетчатки в взрослых данио рерио флуоресцентными красителями

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

В естественных условиях переноса гена к шванновских клеток в нерве Грызун седалищного путем электропорации

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

Одноклеточная РНК-Seq определенных подмножеств клеток сетчатки ганглия

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Следственный млекопитающих Axon регенерации: В Vivo электропорации взрослых мыши Спинной корень ганглия

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...