Name: transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation
Uploaded: 2011-04-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Den pCAG-gapEGFP plasmid var en gåva från Dr S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmid var en gåva från Dr M. Feller (Berkeley, CA). Vi tackar Dr Edward Ruthazer för att föreslå användning av en två-plasmid strategi för enskild cell märkning och Anne Schohl (Montreal, QC) för att validera två plasmid Cre / loxP strategi i förstudier och Crair medlemmar lab för teknisk support. Med stöd av R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) och NIH P30 EY000785 (MC).

1. Utrustning Set-up för elektroporation <ol><li> Elektroder: Vi ändrade Dumont # 5 pincett för att använda som elektroder. <ol><li> Separata och bryta isär pincett. </li><li> Löd en tråd i den bredare slutet av varje stift. Linda fäst och stift med isoleringstejp lämnar ca 25-30 mm av spetsen på den exponerade stift. </li><li> Sätt ändrade pincett tillbaka tillsammans med eventuella lämpliga plastmellanlägget (t.ex. en knapp) mellan de två stiften för att ge vår handling. </li></ol></li><li>...

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

I denna video visar vi ett in vivo-elektroporering protokoll som resulterar i märkningen av enskilda eller små grupper av näthinnans nervceller i postnatala möss med DNA-konstruktioner kodning fluorescerande proteiner. Små grupper av fluorescerande RGC prognoser till dLGN och SC reproduceras liknande projektion mönster som tidigare studier med RGC märkning med lipofila färgämnen, vilket indikerar att elektroporation inte störa normala RGC axonet berså förfining. Vi har utnyttjat detta protokoll för...

<table border="1"><tbody><tr><th> Material </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Tång </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td></tr><tr><td> Elektrisk Stimulator </td><td> Gräs Instrument </td><td> Modell S4 </td></tr><tr><td> Oscilloskop </td><td> Agilent </td><td> Modell 54621A </td></tr><tr><td> Audio monitor </td><td> Gräs Instrument </td><td> Modell AM8B </td></tr><tr><td> Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Saxar en </td><td> Världen precisionsinstrument </td><td> 14.003 </td></tr><tr><td> Micro Sax B </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Tång c </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II-systemet </td><td> Drummond Vetenskapliga </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Glaspipetter </td><td> Drummond Vetenskapliga </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Fotpedal </td><td> Drummond Vetenskapliga </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Mineralolja </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimetylformamid </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

Den inriktning och förädling av RGC prognoser till mitthjärnan är en populär och kraftfull modell för att studera hur exakt mönster av neurala anslutning bildas under utveckling. Hos möss är retinofugal projektioner arrangerade i en topografisk sätt och bildar ögon-specifika lager i Lateral geniculate Nucleus (dLGN) av thalamus och Superior colliculi (SC). Utvecklingen av dessa exakta mönster av retinofugal prognoser har ofta studerats av märkning populationer av RGC: er med fluorescerande färger och spårämnen, som pepparrotsperoxidas 1-4. Men dessa metoder är för grov för att ge insikt i utvecklingsmässiga förändringar i enskilda RGC axonal berså morfologi som ligger till grund för retinotopic karta bildas. De tillåter inte heller för genetisk manipulation av RGC: er. Nyligen har elektroporation blivit en effektiv metod för att ge exakt tid och kontroll för leverans av laddade molekyler i näthinnan 5-11. Aktuell näthinnan elektroporation protokollen tillåter inte genetisk manipulation och spårning av retinofugal projektioner av en enda eller små kluster av RGC: er i postnatal möss. Det har hävdats att postnatal in vivo elektroporering är inte en hållbar metod för transfecting RGC: er eftersom märkningen effektivitet är mycket låg och kräver därför riktade på embryonala åldrar när RGC stamceller genomgår differentiering och proliferation 6. I denna video beskriver vi en in vivo-elektroporering protokoll för målstyrning av gener, shRNA, och fluorescerande dextraner mot murina RGC: er efter födseln. Denna teknik ger en kostnadseffektiv, snabb och relativt enkel plattform för effektiv screening av gener involverade i flera delar av neurala utveckling inklusive axonet dementi, förgrening, laminering, förnyelse och synaps bildning i olika stadier av kretsen utveckling. Sammanfattningsvis beskriver vi här ett värdefullt verktyg som kommer att ge ytterligare insikter i de molekylära mekanismerna bakom sensorisk kartan utveckling.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Vi visar en<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation protokoll för transfecting enstaka eller små grupper av retinal ganglion celler (RGC: er) och andra retinal celltyper i postnatala möss över ett brett spektrum av åldrar. Förmågan att märka och genetiskt manipulera postnatal RGC: er<em&gt; In vivo</em&gt; Är ett kraftfullt verktyg för utvecklingsstudier.

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

En isolerad näthinnan förberedelse till Record Ljus Svar från Genetiskt Märkta Retinal ganglion celler

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mus I livmodern Elektroporation: Kontrollerad Spatiotemporal Gene Transfektion

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Genöverföring till utvecklingsländerna Mouse innerörat genom<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporering

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

Retrograd Märkning av retinal ganglion celler i vuxna zebrafisk med fluorescerande färger

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Genöverföring in vivo till Schwann-celler i gnagare ischiasnerven genom elektroporering

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

En-cell-RNA-Seq av definierade deluppsättningar av retinala Ganglion-celler

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Optisk koherenstomografi: Imaging mus Retinal Ganglion celler In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Utredande däggdjur Axon regenerering: In Vivo elektroporation av vuxen mus dorsalrotsganglier Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...