Name: ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00
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InDevR erkennt NIH / NIAID U01AI070276 und R43AI077112 für die Finanzierung dieser Arbeit.

1. Probe-Amplifikation mit RT-PCR <ol><li> Auszug viraler RNA aus klinischem Material oder ein Virusisolat mit dem Qiagen MinElute Virus Spin Kit in Verbindung mit dem QIAcube automatisierte Nukleinsäure-Extraktion-Plattform. Extraktionen auf 200 ul Probe mit einer abschließenden Elutionsvolumen von 60 ul durchgeführt. Shop-Extrakte bei -70 ° C oder niedriger für die spätere Verwendung. </li><li> In einer Vorlage frei-Bereich bereiten die RT-PCR Master Mix auf Eis nach dem Protokoll des Herstellers. Zur Einarbei...

<ol>
	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. 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Die ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis hier vorgestellte Technologie ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zu einfarbigen Fluoreszenzdetektion für geringere Dichte Microarray-Anwendungen. Schematisch in Abbildung 1 dargestellt, ist der Nachweis grundsätzlich auf die Verwendung eines Photoinitiators Label (1B) basiert. In der Gegenwart eines Monomer-haltigen Lösung (1C), bewirkt Belichtung der Photoinitiator (ampliTAG), um eine Polymerisationsreaktion nur in gekennzeichneten Bereichen (1D...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagenz / Ausrüstung </th><th> Hersteller </th><th> Catalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Virus Spin Kit </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> Einzel 60 ul Elutionspuffer </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> fakultativ </td></tr><tr><td> ABI 9800 Schnelle Thermal Cycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> kit dNTPs nicht verwendet </td></tr><tr><td> 2x Spotting-Puffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda-Exonuklease </td><td> Epicentre Biotechnologies </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip Primermischung </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> noch nicht verfügbar zum Verkauf </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Madell Technologie </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Wash Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Wash Racks </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2x Hybridisierungspuffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Calibration Chips </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Waschpuffer AD </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY Enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA-Mikroarrays wurden als ein mächtiges Werkzeug für den Erregernachweis entstanden. 1-5 So viele Beispiele für die Fähigkeit, Typ und Subtyp Influenza-Virus nachgewiesen wurden. 6-11 Die Identifizierung und Subtypisierung von Influenza auf DNA-Mikroarrays wurde Anwendungen sowohl im öffentlichen Gesundheit und die Klinik für die Früherkennung, die ein rasches Eingreifen und die Minimierung der Auswirkungen einer Influenza-Pandemie. Traditionelle Fluoreszenz ist derzeit die am häufigsten verwendeten Microarray-Nachweisverfahren. Doch wie Microarray-Technologie schreitet in Richtung klinische Anwendung, 1 ersetzt teure Instrumente mit geringen Kosten-Detection-Technologie präsentiert ähnlichen Leistungsmerkmalen zur Fluoreszenz wird Microarray-Assays attraktiver und kostengünstiger. Die ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie ist für die Forschung Anwendungen gedacht und hat eine Nachweisgrenze innerhalb einer Größenordnung von traditionellen Fluoreszenz 11, mit einem Vorteil wird eine ungefähre zehnfach niedrigeren Gerätekosten im Vergleich zum konfokalen Mikroarray-Scanner für Fluoreszenz-Mikroarray erforderlich Erkennung. Ein weiterer Vorteil ist die kompakte Größe des Instruments, die für Portabilität und Flexibilität ermöglicht, im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Instrumente. Da die Polymerisation Technologie ist nicht als inhärent linear als Fluoreszenz-Detektion ist es jedoch am besten für geringere Dichte Microarray-Anwendungen, bei denen eine Ja / Nein Antwort auf das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz gewünscht wird, wie für den Erregernachweis Arrays geeignet. Derzeit die maximale Spotdichte mit ampliPHOX Erkennung ~ 1800 Punkte / array. Wegen der Spotdichte Einschränkungen sind höhere Dichte Microarrays nicht geeignet für ampliPHOX Erkennung. Hier präsentieren wir ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie als eine Methode der Verstärkung von Signalen auf eine geringe Dichte Microarray für die Detektion und Charakterisierung von Influenza-Viren (FluChip) entwickelt. Obwohl dieses Protokoll nutzt die FluChip (ein DNA-Microarray) als eine spezifische Anwendung des ampliPHOX-Erkennung, eine Microarray Einbeziehung biotinylierten Ziel kann beschriftet und in ähnlicher Weise erkannt werden. Die Microarray-Design und Biotinylierung des Ziels zu erfassen liegen in der Verantwortung des Nutzers. Sobald die biotinylierten Ziel ist auf dem Array erfasst wurde, kann ampliPHOX Erkennung durch erste Tagging durchgeführt werden das Array mit einem Streptavidin-label-Konjugat (ampliTAG). Nach Belichtung mit dem ampliPHOX Reader Instrument, Polymerisation einer Monomerlösung (ampliPHY) tritt nur in Regionen mit ampliTAG-markierten Ziele. Das gebildete Polymer kann anschließend mit einem ungiftigen Lösung visuellen Kontrast zu verbessern, indem Abbildung und Analyse mit einem einfachen Software-Paket (ampliVIEW) gefolgt gefärbt werden. Die gesamte FluChip Assay von un-extrahierten Probe bis zum Ergebnis kann in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, und die ampliPHOX Erkennung oben beschriebenen Schritte können in ca. 30 min abgeschlossen sein.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

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Forschung

Immunologie und Infektion

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Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

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Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

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Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

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Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...