Name: ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza
Uploaded: 2011-06-09T12:00:00
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InDevR reconhece NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 para financiamento deste trabalho.

1. Ampliação da amostra utilizando RT-PCR <ol><li> Extrato de RNA viral a partir de material clínico ou de um isolado viral utilizando o Kit Qiagen MinElute rotação de vírus em conjunto com a plataforma de extração de ácidos nucleicos QIAcube automatizado. Extrações são realizadas em 200 mL de amostra com um volume de eluição final de 60 mL. Extratos armazenar a -70 ° C ou menor para uso posterior. </li><li> Em um modelo de área de livre, prepare o RT-PCR Master Mix no gelo acordo com o protocolo do fa...

<ol>
	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. 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A tecnologia de detecção colorimétrica ampliPHOX aqui apresentada é uma alternativa rápida e barata para detecção de uma única cor de fluorescência para aplicações de menor densidade de microarray. Mostrado esquematicamente na Figura 1, o princípio de detecção é baseado no uso de uma etiqueta fotoiniciador (1B). Na presença de uma solução de monômero contendo (1C), a exposição à luz faz com que o fotoiniciador (ampliTAG) para desencadear uma reação de polimerização apenas em re...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / equipamentos </th><th> Fabricante </th><th> Catalogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Kit Qiagen MinElute rotação Virus </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> eluição 60 mL única </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> opcional </td></tr><tr><td> ABI 9800 Rápido Termociclador </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> kit dNTPs não utilizados </td></tr><tr><td> Tampão Spotting 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Mix dNTP biotinilado </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Exonuclease Lambda </td><td> Biotecnologias Epicentre </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip mistura de iniciadores </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> ainda não disponível para venda </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Madell Tecnologia </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Bins </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Racks </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de hibridação 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Fichas de calibração </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lavar Buffers AD </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY enhancer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

DNA microarrays têm emergido como uma poderosa ferramenta para a detecção de patógenos. 1-5 Por exemplo, muitos exemplos da capacidade de tipo e subtipo do vírus influenza tem sido demonstrado. 6-11 A identificação e subtipos de gripe em microarrays de DNA tem aplicações tanto em público saúde e da clínica para a detecção precoce, intervenção rápida, e minimizar o impacto de uma pandemia de influenza. Fluorescência tradicional é atualmente o método de detecção mais comumente utilizados microarray. No entanto, como tecnologia de microarray progride para uso clínico, uma substituindo a instrumentação caros com tecnologia de detecção de baixo custo que apresentem características de desempenho semelhante ao de fluorescência fará ensaios de microarray mais atrativo e rentável. A tecnologia de detecção colorimétrica ampliPHOX é destinado a aplicações de pesquisa, e tem um limite de detecção dentro de uma ordem de magnitude da fluorescência tradicionais 11, com uma vantagem principal é um valor aproximado de dez vezes menor custo em comparação com o instrumento scanners microarray confocal de fluorescência necessários para microarray detecção. Outra vantagem é o tamanho compacto do instrumento que permite a portabilidade e flexibilidade, ao contrário dos tradicionais instrumentos de fluorescência. Porque a tecnologia de polimerização não é tão linear como inerentemente detecção de fluorescência, no entanto, é mais adequado para aplicações de menor densidade microarray em que um sim / não respondeu para a presença de uma determinada seqüência é desejada, como, por matrizes de detecção de patógenos. Atualmente a densidade local máxima compatível com a detecção ampliPHOX é de aproximadamente 1.800 pontos / matriz. Devido às limitações de densidade local, microarrays maior densidade não são adequados para a detecção ampliPHOX. Aqui, apresentamos ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica como um método de amplificação de sinal em um microarray de baixa densidade desenvolvido para a detecção e caracterização dos vírus influenza (FluChip). Embora este protocolo utiliza o FluChip (um microarray de DNA) como uma aplicação específica do ampliPHOX detecção, qualquer microarray incorporando-alvo biotinilado pode ser rotulada e detectado de forma similar. O projeto microarray e Biotinilação do alvo a ser capturada são de responsabilidade do usuário. Uma vez que o alvo biotinilado foi capturado na matriz, detecção ampliPHOX pode ser realizada por marcação a primeira matriz com um conjugado de estreptavidina-label (ampliTAG). Após a exposição à luz usando o instrumento ampliPHOX Leitor de polimerização, de uma solução de monômero (ampliPHY) ocorre somente em regiões contendo ampliTAG marcado alvos. O polímero formado pode ser posteriormente coradas com uma solução não tóxica para melhorar o contraste visual, seguido de imagem e análise usando um pacote de software simples (ampliVIEW). O ensaio FluChip inteira de un-extraído de amostra para resultado pode ser realizado em cerca de 6 horas, e as etapas de detecção de ampliPHOX descrito acima pode ser concluído em cerca de 30 min.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Research

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