Name: imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00
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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (GM093282 para PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fundos de inicialização do Albert Einstein College of Medicine.

1. Coleta de ovos e Dechorionation <ol><li> Coletar e transferir os ovos zebrafish a 35mm placa de Petri, remova tanta água quanto possível e então adicione 1 E Pronease mg / ml em meio embrião E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir o córion. </li><li> Depois de 3-5 minutos, fundir o prato em um copo cheio de água de peixe (60 mg &quot;Ocean instantânea&quot; por litro destilada H 2 O), e gentilmente transferir os ...

<ol>
	<li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+glycome.">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li><li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+Covalent+labeling+in+living+systems.">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li><li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+copper(I)+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans.">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li><li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li><li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish.">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li><li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis.">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives.">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map.">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Biomoléculas de imagem<em&gt; In vivo</em&gt; Fornece uma visão crítica de suas atividades biológicas em seus ambientes nativos. Neste vídeo, demonstramos como a rotulagem dos glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish é realizado por microinjecting embriões de uma célula palco com PIB FucAl e uma conjugação fluoróforo segunda etapa via BTTES mediada CuAAC biocompatível<sup&gt; 3</sup&gt;. Etiquetagem robusta pode ser conseguido dentro de 2-3 minutos, e os glicanos rotulados são det...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Cobre pentahidratado sulfato (II) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azida </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextran, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+) De sódio-L-ascorbato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic ácido </td><td> Acros Organics </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Prato fundo de vidro micropoços </td><td> Mattek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry

Glicanos de imagem in vivo foi recentemente ativado usando uma estratégia repórter bioorthogonal química por tratar células ou organismos com azida ou alcino marcadas monossacarídeos 1, 2. Os monossacarídeos modificado, processados ​​pela máquina biossintética glicano, são incorporados glicoconjugados de superfície celular. As tags bioorthogonal azida ou alcino então permitir a conjugação covalente com sondas fluorescentes para a visualização, ou afinidade com sondas para o enriquecimento e análise glycoproteomic. Este protocolo descreve os procedimentos normalmente utilizados para imagem não invasivos de glicanos fucosylated em embriões de peixe-zebra, incluindo: 1) microinjeção de um celular em embriões em estágio com o PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish com azida conjugada fluoróforos via Cu biocompatível (I)-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC), e 3) de imagens por microscopia confocal 3. O método descrito aqui pode ser facilmente estendido para visualizar as outras classes de glicanos, glicanos por exemplo, contendo ácido siálico 4 e N-acetilgalactosamina 5, 6, em zebrafish em desenvolvimento e em outros organismos vivos.

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Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Um método baseado em clique química que permite a rotulagem, rápida não invasiva, e robusta de alcino com tags glicanos em embriões de peixe-zebra é descrito. Glicanos Fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish na fase final de gastrulação foram fotografadas neste estudo.

Glicanos imagem em embriões Zebrafish por Labeling Metabólica e Química Clique Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

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Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

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Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

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Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

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Confirmação via metabólica e descoberta através 13 C-rotulagem de proteinogénicos Aminoácidos

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A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabólica Rotulagem de Leucina rico Repita Kinases 1 e 2 com Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...