Name: imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry
Uploaded: 2011-06-06T15:00:00
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Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM093282 a PW; 3U54AI057158-06S1 de RDS) y los fondos de puesta en marcha de Albert Einstein College of Medicine.

1. Recolección de huevos y Dechorionation <ol><li> Recoger y traspasar los huevos de pez cebra a 35 mm placa de Petri, eliminar la mayor cantidad de agua posible y luego agregar 1 mg / ml en el medio de E Pronease embrión E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir el corion. </li><li> Después de 3-5 minutos, combinar el plato en un vaso lleno de peces de agua (60 mg &quot;Ocean instantánea&quot; por litro de H2O destilada),</su...

<ol>
	<li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+glycome.">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li><li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+Covalent+labeling+in+living+systems.">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li><li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+copper(I)+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans.">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li><li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li><li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish.">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li><li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis.">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives.">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map.">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Imágenes biomoléculas<em&gt; In vivo</em&gt; Proporciona una visión crítica de sus actividades biológicas en sus ambientes nativos. En este vídeo, se demuestra cómo el etiquetado de los glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra se realiza mediante la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-FucAl y una conjugación fluoróforo segundo paso a través de BTTES mediada CuAAC biocompatible<sup&gt; 3</sup&gt;. Etiquetado sólida se puede lograr en 2-3 minutos, y los gl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De cobre (II) sulfato pentahidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 203165 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 azida </td><td> Invitrogen </td><td> A10266 </td></tr><tr><td> dextrano, Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> D-22913 </td></tr><tr><td> (+)-L-ascorbato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic ácido </td><td> Acros orgánicos </td><td> 164060010 </td></tr><tr><td> Pocillos con fondo de cristal plato </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr></tbody></table>

imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry

Glicanos de imágenes en vivo ha sido recientemente habilitada mediante una estrategia de química reportero bioorthogonal por el tratamiento de las células u organismos con los monosacáridos azida o alquino etiquetados-1, 2. Los monosacáridos modificados, procesados ​​por la maquinaria biosintética de glicanos, se incorporan a glicoconjugados de la superficie celular. Las etiquetas bioorthogonal azida o alquino luego permitir que la conjugación covalente con sondas fluorescentes para la visualización, o con sondas de afinidad para el enriquecimiento y el análisis glycoproteomic. Este protocolo describe los procedimientos que normalmente se utiliza para obtener imágenes no invasivo de los glicanos fucosilados en embriones de pez cebra, incluyendo: 1) la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) El etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra con azida fluoróforos conjugados a través de Cu biocompatible (I) catalizada por azida-alquino cicloadición (CuAAC), y la imagen 3) por microscopía confocal 3. El método descrito aquí puede extenderse fácilmente para visualizar las otras clases de glicanos, por ejemplo, los glicanos que contienen ácido siálico 4 y N-acetilgalactosamina 5, 6, en el pez cebra en desarrollo y en otros organismos vivos.

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Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Un método de hacer clic química base que permite el etiquetado rápido, no invasivo, y robusto de alquino con etiquetas glicanos en embriones de pez cebra se describe. Glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra en la etapa de gastrulación finales fueron estudiados en este estudio.

Glicanos imágenes en embriones de pez cebra mediante marcado metabólico y Química Haga clic Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Research

JoVE Journal

Biology

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Investigación

Biología

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...