Name: invasion of human cells by a bacterial pathogen
Uploaded: 2011-03-21T11:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (WT 0795880).

وبروتوكول التالية تصف الدراسة لغزو الخلايا البطانية التي كتبها S. ويمكن نظريا المذهبة ولكن يمكن استخدامها لدراسة الغزو الخليوي عن أي بكتيريا زروع. مراحل محددة لS. يشار المذهبة والبطانية الخلايا. 1. اعداد البكتيريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة س سلالات المكورات ل16/04 ساعة (تبعا لمرحلة النمو المطلوبة) في 10 مل الدماغ و القلب مرق (بهي) تسريب عند 37 درجة مئوية في الهواء مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. هذه الشروط هي محددة لنمو س. قد المذهبة ، وتحتاج إلى تكييف للبكتيريا أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البكتيريا ثلاث مرات في المتوسط ​​Dulbecco في التعديل النسر (DMEM ؛ Invitrogen) بواسطة قذائف بديلة للطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة (5000 س ز ، 10 دقيقة) ، وإزالة لطاف والثقافة ، وإعادة تعليق من بيليه الجرثومي في وحدة تخزين ما يعادل DMEM. قياس كثافة بصرية لتعليق الناتجة من البكتيريا ومن ثم يمكن تعديله على النحو المطلوب. لS. المذهبة ، ونحن نستعد تعليق على OD 600 = 1 ، والذي يتوافق مع 10 ~ 9 -1 مل CFU. </li></ol> 2. الخلية البطانية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة خط الخلية البطانية EA.hy926 1 في DMEM تستكمل مع الجنين مصل الأبقار (FBS ؛ 10 ٪) والجلوتامين L - (2 ملم) في 37 درجة مئوية في ثاني ٪ 5 2. بدلا من ذلك ، يمكن شراؤها المجمعة الأولي الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) من Lonza (بازل ، سويسرا) والمثقف في المتوسط ​​القاعدية البطانية تستكمل مع FBS 2 ٪ ، واستخراج الدماغ البقري (بما في ذلك الهيبارين) ، والبشرية عامل النمو البطاني والهيدروكورتيزون في 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Lonza). هذه الشروط هي محددة لنمو هذه الخلايا ، وربما تحتاج إلى أن تتكيف لغيرها من أنواع الخلايا المضيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا بطانية T75 في قوارير لإكمال confluency ، التحقق من العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات 24 - جيدا لادراج coverslips. وهناك حاجة إلى ملقط غرامة (لهب تعقيمها) لنقل coverslips التي سطح واحد لامعة شفافة واحد. coverslips مكان في الآبار من 24 لوحة جيدا مع سطح معتم تواجه صعودا للسماح مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرير الخلايا من القارورة T75 مع 3 مل التربسين - EDTA (0.25 ٪) وإضافة إلى 10 مل من مستنبت ذات الصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى جانب 24 لوحات تحتوي على زجاج coverslips Thermanox. قدم أحد T75 قارورة متموجة من الخلايا خلايا كافية لوحات 24 على اثنين ، مما أدى إلى حوالي 5 × 10 5 خلايا لكل بئر (في المتوسط ​​500 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة 48 ساعة كما هو موضح أعلاه ، وتحقق 100 ٪ الخلية confluency بواسطة المجهر الضوئي مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع غسل coverslips في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى لوحات 24 بئر جديدة تحتوي على 490 DMEM ميكرولتر FBS تحتوي على 10 ٪ في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للنظر في دور العمليات الأيضية محددة في غزو الخلايا ، يمكن إضافة مثبطات إلى الخلايا المستزرعة ح 1 قبل إضافة البكتيريا وتجمعات المحافظة خلال الفحص. على سبيل المثال ، لتحديد دور في إعادة ترتيب أكتين س. غزو ​​الخلايا البطانية المذهبة ، ويمكن اضافة 50 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D ، أو لدور caveolae ، 5 ملي الميثيل β - cyclodextrin يمكن إضافتها. </li></ol> 3. غزو ​​الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من البكتيريا غسلها (مما أدى إلى ما يقرب من 2 × 10 7 مل CFU المذهبة س -1) التي تحتوي على كل بئر ساترة غسلها مع طبقة من الخلايا البطانية متكدسة في 490 DMEM ميكرولتر تحتوي على 10 ٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان 15-90 دقيقة في 37 في 5 ٪ CO 2 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس العدد الكلي للبكتيريا المرتبطة الخلايا (ملتصقة والمنضوية) ، وتراجع في غسل coverslips ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وإضافة إلى آبار جديدة تحتوي على 500 ميكرولتر تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. لضمان الخلايا ليز بالكامل والإفراج عن جميع البكتيريا المنضوية ، ماصة لعدة مرات ، لافتا غيض من ماصة مباشرة على سطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد البكتيريا عن طريق طلاء تعليق السائل (أو التخفيفات هذا إذا لزم الأمر) على سطح اللوحات TSA. منذ TX - 100 وليز العديد من الجراثيم سلبية الغرام ، يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك سابونين 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس عدد من البكتيريا المنضوية ، إزالة طاف الثقافة من كل البكتيريا غير منضم يحتوي جيدا واستبدالها ب 500 ٪ FBS DMEM/10 ميكرولتر تستكمل مع 200 ميكروغرام جنتاميسين -1 مل. نستخدم عادة جنتاميسين بدلا من lysostaphin هنا كما هو أرخص ويسمح لنا للتبديل بين التجارب باستخدام أنواع مختلفة من البكتيريا (مثل المكورات العنقودية وLactococci) دون الحاجة إلى تغيير بروتوكول التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2 لمدة 60 دقيقة لقتل جميع الجراثيم خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3 مرات في برنامج تلفزيوني ،ليز و تعداد بواسطة الطلاء على TSA صفه للمقايسة التصاق أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بعض الحالات قد يكون من الأفضل أن نعتمد بصريا عدد من البكتيريا باستخدام المجهر الضوئي. في هذا المثال ، ومحددة لس. المكورات غزو الخلايا ، استخدم lysostaphin (10 ميكروغرام مل -1) بدلا من الجنتاميسين لتدمير البكتيريا فعليا خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان coverslips 20min عند 37 درجة مئوية في ثاني 2 في حل lysostaphin ، ثم شطف والإصلاح مع Cytopath (Cellpath). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفيضانات coverslips مع الكريستال البنفسجي (0.5 ٪ ، ث / ت) ل5min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الماء ، والهواء الجاف وتراجع شطف جبل على الشرائح الزجاجية. ويمكن قياس عدد من البكتيريا في 2 مم من الخلايا البطانية متموجة باستخدام المجهر الضوئي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : التعبير عن البروتينات ملزمة فبرونيكتين (FnBPA وFnBPB) على سطح س. المكورات يمنح القدرة على غزو الخلايا البطانية. الأعمال الأخيرة أدى إلى إعادة تعريف المجال فبرونيكتين الملزم FnBPA 3. البرية من نوع (WT) س. المكورات 8325.4 يغزو الخلايا البطانية ذات كفاءة عالية ، في حين تفتقر سلالة كلا FnBPA وباء (Δ FNB) أظهرت انخفاض مستويات كبيرة من تدخيل (الشكل 1A). تكامل للمتحولة مع ترميز FNB البلازميد ناقص لم المجال فبرونيكتين ملزم (pFnR0) لا تشجع الغزو (الشكل 1A). على النقيض من ذلك ، تكامل للمتحولة مع ترميز البلازميد في FNB كامل المورثة (pFnBA4) استعادة الغزو إلى مستويات WT (الشكل 1A). ويمكن أيضا دور في غزو FnBPA الخلية البطانية يمكن أظهر باستخدام المضيف اللبنية التعبير Lactococcus مغاير. التعبير عن بلازميد ترميز FnBPA في L. لم اللبنية (pRM9 9) لن يعزز بشكل ملحوظ لالتصاق الخلايا البطانية مقارنة البكتيريا معربا عن أي FnBPA (CTL) (الحانات مفتوحة ، 1B الشكل). على النقيض من ذلك ، معربا عن FnBPA - L. غزت اللبنية الخلايا البطانية على مستويات أعلى بكثير من سلالة غير التعبير عن (الحانات التي أغلقت ، 1B الشكل). وأجريت التجارب في مكررة أربع مرات ، وقدم يعني ± الانحراف المعياري. * تمثيل البيانات الإحصائية التي تختلف اختلافا كبيرا (ع = &lt;0.05) من وزن أو قيم CTL. <img src="/files/ftp_upload/2693/2693fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. غزو EA. Hy926 الخلايا البطانية التي كتبها س. الذهبية (A) أو L. اللبنية (B).

<ol>
	<li>Edgell, C. J., McDonald, C. C., Graham, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permanent+cell+line+expressing+human+factor+VIII-related+antigen+established+by+hybridization.">Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 3734-3737 (1983).</li><li>Makino, S., van Putten, J. P., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+variation+of+the+opacity+outer+membrane+protein+controls+invasion+by+Neisseria+gonorrhoeae+into+human+epithelial+cells.">Phase variation of the opacity outer membrane protein controls invasion by Neisseria gonorrhoeae into human epithelial cells.</a> EMBO J. 10, 1307-1315 (1991).</li><li>Schwarz-Linek, U., Werner, J. M., Pickford, A. R., Gurusiddappa, S., Kim, J. H., Pilka, E. S., Briggs, J. A., Gough, T. S., Höök, M., Campbell, I. D., Potts, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+attach+to+human+fibronectin+through+a+tandem+beta-zipper.">Pathogenic bacteria attach to human fibronectin through a tandem beta-zipper.</a> Nature. 423, 177-181 (2003).</li><li>Magoffin, R. L., Spink, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protection+of+intracellular+Brucella+against+streptomycin+alone+and+in+combination+with+other+antibiotics.">The protection of intracellular Brucella against streptomycin alone and in combination with other antibiotics.</a> J. Lab. Clin. Med. 37, 924-930 (1951).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria.">Interaction of intraleukocytic bacteria.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes.">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 16, 743-749 (1979).</li><li>De Melo, M. A., Pechere, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+mucin+on+Campylobacter+jejuni+association+and+invasion+on+HEp-2+cells.">Effect of mucin on Campylobacter jejuni association and invasion on HEp-2 cells.</a> Microb. Pathog. 5, 71-76 (1988).</li><li>Shaw, J. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+invasion+of+human+tissue+culture+cells+by+Neisseria+gonorrhoeae.">Model for invasion of human tissue culture cells by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infect. Immun. 56, 1625-1632 (1988).</li><li>Edwards, A. M., Potts, J. R., Josefsson, E., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+Host+Cell+Invasion+and+Virulence+in+Sepsis+is+Facilitated+by+the+Multiple+Repeats+within+FnBPA.">Staphylococcus aureus Host Cell Invasion and Virulence in Sepsis is Facilitated by the Multiple Repeats within FnBPA.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000964-e1000964 (2010).</li><li>Meyer, D. H., Sreenivasan, P. K., Fives-Taylor, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+invasion+of+a+human+oral+cell+line+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.">Evidence for invasion of a human oral cell line by Actinobacillus actinomycetemcomitans.</a> Infect. Immun. 59, 2719-2726 (1991).</li><li>Edwards, A. M., Grossman, T. J., Rudney, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusobacterium+nucleatum+transports+noninvasive+Streptococcus+cristatus+into+human+epithelial+cells.">Fusobacterium nucleatum transports noninvasive Streptococcus cristatus into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 74, 654-662 (2006).</li><li>Menzies, B. E., Kourteva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+Staphylococcus+aureus+by+Endothelial+Cells+Induces+Apoptosis.">Internalization of Staphylococcus aureus by Endothelial Cells Induces Apoptosis.</a> Infect. Immun.. 66, 5994-5998 (1998).</li><li>Schr&#246;der, A., Schröder, B., Roppenser, B., Linder, S., Sinha, B., Fässler, R., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+fibronectin+binding+protein-A+induces+motile+attachment+sites+and+complex+actin+remodeling+in+living+endothelial+cells.">Staphylococcus aureus fibronectin binding protein-A induces motile attachment sites and complex actin remodeling in living endothelial cells.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 5198-5210 (2006).</li><li>Molinari, G., Rohde, M., Talay, S. R., Chhatwal, G. S., Beckert, S., Podbielski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Cue, D., Dombek, P. E., Lam, H., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+pyogenes+serotype+M1+encodes+multiple+pathways+for+entry+into+human+epithelial+cells.">Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 66, 4593-4601 (1998).</li><li>Eiff, C. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+small+colony+variants:+a+challenge+to+microbiologists+and+clinicians.">Staphylococcus aureus small colony variants: a challenge to microbiologists and clinicians.</a> Int J. Antimicrob. Agents. 31, 507-510 (2008).</li><li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria.">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 415-425 (2010).</li><li>Wang, B., Yurecko, R. S., Dedhar, S., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-linked+kinase+is+an+essential+link+between+integrins+and+uptake+of+bacterial+pathogens+by+epithelial+cells.">Integrin-linked kinase is an essential link between integrins and uptake of bacterial pathogens by epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 8, 257-266 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> يستند مقايسة وصفنا على مقايسة حماية الجنتاميسين ، والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة غزو الخلايا المضيفة البكتيريا. واستخدمت ملاحظات لعدم قدرة المضادات الحيوية وغيرها من الجنتاميسين لقتل البكتيريا داخل الخلايا في الدراسات المبكرة على غزو الخلايا المضيفة 4-8 البكتيريا. استخدام 48 أو 24 أو حتى 96 - جيدا يسمح لوحات توليد كميات كبيرة من البيانات ، وكمية استنساخه في فترة قصيرة من الوقت وبتكلفة منخفضة نسبيا. في مقايسة غير جذابة أيضا لأنها لا تتطلب معدات متخصصة ، يمكن أن تكون مصممة للعمل مع مختلف الجراثيم والخلايا ، ويمكن استخدامها لدراسة دور كل من عمليات الخلية البكتيرية والمضيفة في غزو 9. في الواقع ، منذ وقت التجارب ، وقد تم فحص الحماية المستخدمة على نطاق واسع الجنتاميسين لقياس الخلية المضيفة غزو من قبل مجموعة من البكتيريا أو تركيبات مختلفة من البكتيريا حتى 10،11. في حين أن المبادئ الأساسية هي أن العديد اختلافات دقيقة في نفس الأسلوب قد تم الإبلاغ عنها. في هذه المقالة قد وصفنا نسختنا وأشار إلى التعديلات التي قد تكون ضرورية لغيرها من البكتيريا أو الخلايا المضيفة. عند تصميم تجربة لقياس المضيف غزو الخلايا باستخدام هذا النهج أن هناك عددا من النقاط الهامة في الاعتبار : الحساسية البكتيرية للجنتاميسين. قد يبدو هذا واضحا ، ولكن من المهم التأكد من أن هذه البكتيريا التي يجرى بحثها هي عرضة للجنتاميسين في درجة الحرارة ، وتركيز وعلى مدى الفترة الزمنية التي يتعين استخدامها. في حالة عدم الاكتراث ، فإنه قد يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية الأخرى 5. ويمكن اتباع نهج بديل يتمثل في استخدام الإنزيمات lytic (lysostaphin ، mutanolysin ، الليزوزيم) 12. حضانة وقيحة. عند تنفيذ هذا الاختبار للمرة الأولى ، من المهم لإنشاء حضانة مرات الأمثل واللقاح الجرثومي لاستخدامه. ولذلك ، ينبغي النظر في التجارب الأولية على حد سواء التصاق والغزو على مر الزمن (5 دقائق ليصل الى 6 ساعات). من المهم أيضا لتقييم مدى تأثر غزو من جانب تعدد العدوى (وزارة الداخلية ، وعدد من البكتيريا في الخلية). عموما فإنه من الأفضل استخدام عدد من البكتيريا بأقل عدد ممكن لأن هذا سيؤدي إلى تقليل الأضرار إلى الخلايا المستزرعة. قد يكون غاب عن اختلافات مهمة بين سلالات إذا فترات حضانة طويلة أو قائح كبيرة تستخدم 9،13. تلف الخلايا ، ومن المهم أن يغسل البكتيريا قبل الاستخدام. ومع ذلك ، لا يقتصر الضرر الخلوي لإنتاج السم. الغزو الجرثومي ، ويمكن استحثاث موت الخلايا المبرمج ، وتعطل الوظائف الخلوية العادية تتسبب جميع الأضرار الخلوية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تغلغل الجنتاميسين في الخلية ، وقتل البكتيريا المنضوية إعطاء الانطباع بأن الغزو لم يحدث 14. شروط الحضانة. ويمكن لدرجة الحرارة وتكوين ثقافة المتوسطة يكون لها تأثير كبير على الغزو. على سبيل المثال ، والغزو من الخلايا العقدية المقيحة هيلا التي تعتمد على وجود فبرونيكتين القابلة للذوبان ، والتي هي عادة موجودة في المصل 15. وهناك اعتبار آخر هو نمو البكتيريا في مستنبت أثناء التجربة. ثقافة وتقدير من البكتيريا داخل الخلايا. وعلى الرغم TX - 100 قد لا تقتل البكتيريا داخل الخلايا ، فإنه قد تحول دون نموها. على هذا النحو ، فمن المهم للتحقق من النسخ المتماثل على وسائط جرثومية الصلبة في وجود المنظفات. حيث تتأثر ، قد يكون من الممكن استخدام تركيزات أقل من المنظفات أو استخدام بديل مثل سابونين. وهناك فائدة للمقايسة حماية الجنتاميسين على تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري هو أنه أقل من العمالة المكثفة ، وأنها تسمح للكشف والتمييز بين المجموعات الفرعية من السكان من البكتيريا المنضوية. على سبيل المثال ، S. يمكن أن تنتج إما المذهبة نوع مستعمرة العادي (NCT) أو المتغير مستعمرة صغيرة (SCV) 16 ، والتي لن تكون مميزة من خلال الفحص المجهري للخلايا بكتيرية الفردية. وهناك فائدة من تلطيخ البنفسجي الكريستال والفحص المجهري على مقايسة حماية الجنتاميسين هو يمكن شكلت خلية للتكتل وأن البكتيريا التي تدخل الخلايا &quot;قابلة للحياة ولكن غير زروع&quot; وسيتم الكشف عن 17 حالة. دراسة دور عمليات الخلية المضيفة في الغزو الجرثومي. استخدمت العديد من الدراسات مثبطات وظيفة الخلايا المضيفة مثل D مثبط حركة الخلايا ، والتي تتعارض مع إعادة ترتيب أكتين. مثل هذه الدراسات يمكن أن تشمل أيضا الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات سطح الخلية وضربة قاضية للجينات محددة سيرنا 18. من المهم جدا للتأكد من أن هذه العلاجات لا تؤثر على صلاحية أو مرفق من الخلايا المستنبتة أو تكون لها آثار سامة على البكتيريا. التوجهات المستقبلية : ontent &quot;&gt; لأنه يتم عادة إجراء هذا الاختبار في لوحات متعددة جيدا ثقافة الخلية ، فمن الممكن نظريا لتكييفه مع عملية الفرز الفائق الإنتاجية ، والتي قد تنطوي على دراسة المكتبات وظيفة الخلية مثبطات المحتملة ، ومكافحة العدوى أو المضادات الحيوية صممت لاستهداف البكتيريا داخل الخلايا. كبديل ، يمكن أن تستخدم مثل هذا النهج إلى الشاشة متحولة المكتبات لتحديد الجينات المسؤولة عن الالتصاق ، والغزو ، أو البقاء داخل الخلايا ، وفي بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه لتشمل قوى القص (التدفق) في النظام النموذجي ، على سبيل المثال عندما النمذجة البطانة ، على نحو أوثق محاكاة البيئة في الجسم الحي. التقدم الحالي في مجال تصميم وتصنيع الخلايا التدفق ونظم ميكروفلويديك خلية ثقافة توفر إمكانية توظيف مقايسة الجنتاميسين في حماية المضيف الممرض النماذج التي تضم قوى القص. باختصار ، يقوم بروتوكول الموصوفة هنا على النهج المماثلة المستخدمة على مدى سنوات عديدة. فمن على نطاق واسع ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المستزرعة ، والأنواع البكتيرية ويمكن أن تولد كميات كبيرة من البيانات بسرعة وبتكلفة قليلة نسبيا.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31885-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brain heart infusion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioChemika</td>
<td>53286</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10091-148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HUVECs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-2519</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Endothelial basal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-3121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine brain extract (including heparin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human endothelial growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4017C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrocortisone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4035C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GA-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>CC-4092C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15710</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lysostaphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AMBI</td>
<td>LSPN-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermanox coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>TKT-210-330P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytopath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCS Biosciences</td>
<td>HC8595</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystal violet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3886</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T75 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>430641</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochalasin D</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C2618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl-B-cyclodextrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>332615</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

invasion of human cells by a bacterial pathogen

هنا سنقوم بشرح كيف ندرس غزو الخلايا البطانية الإنسان عن طريق البكتيريا العنقودية الذهبية الممرض. ويمكن تطبيق بروتوكول عام لدراسة الغزو خلية بكتيريا أي تقريبا زروع. وسيتم تسليط الضوء على المراحل التي يمكن أن تدرس جوانب محددة من الغزو ، مثل إعادة ترتيب دور الأكتين أو caveolae. تزرع الخلايا المضيفة في قوارير والمصنف عندما جاهزة للاستخدام في 24 لوحات تحتوي كذلك coverslips Thermanox. يسمح باستخدام coverslips اللاحقة إزالة الخلايا من الآبار للحد من التدخل من بروتينات مصل المودعة على الجانبين من الآبار (S. المذهبة التي سوف نعلق). تزرع البكتيريا إلى الكثافة المطلوبة وغسلها لإزالة أي تفرز بروتينات (مثل السموم). يتم نقل Coverslips مع طبقات من الخلايا البطانية متكدسة لوحات 24 بئر جديدة طازجة تحتوي على مستنبت قبل إضافة البكتيريا. ثم يتم تحضين الجراثيم والخلايا معا من أجل المبلغ المطلوب من الوقت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. لS. المكورات هذا هو عادة بين 15-90 دقيقة. تتم إزالة coverslips Thermanox من كل بئر وتراجع غسلها في برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير مرتبط. إذا كان مجموع البكتيريا المقترنة (ملتصقة والمنضوية) هي أن يكون كميا ، ثم توضع في بئر coverslips الطازجة التي تحتوي على تريتون 0.5 ٪ X - 100 في برنامج تلفزيوني. pipetting طيف يؤدي إلى تحلل الخلايا وإكمال يتم تعداد البكتيريا عن طريق التخفيف المتسلسل والطلاء على أجار. اذا كانت هناك حاجة لعدد من البكتيريا التي قد غزت الخلايا ، تضاف إلى coverslips الآبار تحتوي على 500 زراعة الأنسجة ميكرولتر المتوسطة تستكمل مع الجنتاميسين وحضانة استمرت لمدة 1 ساعة ، والتي سوف تقتل كل البكتيريا الخارجية. lysed الخلايا يمكن أن تكون ثم Coverslips غسلها ، والبكتيريا التي تم تعدادها على الطلاء أغار على النحو المبين أعلاه. إذا كانت التجربة يتطلب رؤية مباشرة ، يمكن ان تكون ثابتة وcoverslips ملطخة المجهري للضوء ، أو مضان مبائر أو معدة للفحص المجهري الإلكترون.

Watch this Scientific Journal Video about Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

بروتوكول عام لدراسة غزو الخلايا المضيفة من قبل الممرض الجرثومي ، مع التركيز على<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; والخلايا البطانية الإنسان.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

استخدام مسببات الأمراض بكتيرية للتحقيق لاستجابات المضيف الخلوية ومستوى أورجانيسميك

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي