Name: concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume bio-spec nano spectrophotometer
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer at JoVE.com

1. נוהל quantitation DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת BioSpec ננו משולחן העבודה במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה פשוט חומצה dsDNA גרעין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנה יהיה ליצור תקשורת עם המכשיר ולהפעיל רצף האתחול. זה מוודא כי המכשיר מתפקד בהתאם למפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 0.7 או 0.2 מ&quot;מ על המחוון pathlength. זה בוחר את pathlength וכל החישובים מבוססים על pathlength שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא BioSpec ננו ההתקנה לחץ על הגדרת-Autowiping תוכנה. בחר 1 או 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL (0.7 מ&quot;מ) H 2 O או חיץ על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ריק או F6 למדידת ריק. בכל פעם pathlength חדשה נבחרה יש צורך להקליט ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL של המדגם על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר. החלון העליון מהלכים ליצור קשר עם רביב המדגם. מהבהב קסנון ניתן לצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9. תוצאות ניתן גם לשמור כקובץ csv. באמצעות בחירה בלשונית המתאימה לשמור. </li></ol> 2. פרוטוקול quantitation חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר quantitation הכרטיסייה חלבון (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את e280 מקדם הכחדה, אם הוא ידוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם e280 אינו ידוע לחשב אותו באמצעות e280Calc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 0.7 או 0.2 מ&quot;מ על המחוון pathlength. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על Setup-Autowiping ההתקנה. בחר 2 ומעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 μL (0.2 מ&quot;מ) H 2 O או חיץ על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ ריק או F6 למדידת ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 μL מדגם חלבון על הכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התחל בתוכנה או ללחוץ על הכפתור להתחיל על המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדגם זהה 3 פעמים כדי לקבוע reproducibility. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הנתונים נרשם נשמר כקובץ. ניצן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור כקובץ. Pdf או. קובץ CSV לחץ על שמור PDF / csv או F9. </li></ol> 3. נציג תוצאות: 1. תוצאות עבור quantitation DNA איור 3 מציג את נתוני מדידות על דגימת DNA גדילי כפול טיפוסי. ריכוז ו OD 260/280 יחס מחושב מוצגים גם. איור 4 מכיל מבחן reproducibility תוצאות quantitation DNA. הנתונים איורים 3 ו -4 תוצאות מראה ולייצר מאוד כפי שעולה סטיית תקן נמוכה יחסית של 0.26%. הערה 1: אי דיוק quantitation DNA יכול לנבוע נוכחות של רכיבים חיץ אשר עשוי לספוג באזור UV. זהו גם צורך להשתמש בפתרון מדגם הומוגני. ככל שכמות מדגם pipetted להיות רק 1-2 pipetting μL, נזהר כרכים מדויק ללא הקדמה של בועות בכל הנדרש. 2. תוצאות עבור quantitation חלבון איור 5 מייצג ריכוז חלבון ניתוח BSA. ריכוז מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​חלבון מבוססת על ערך e280. איור 6 מציג ניתוח שחזור. ברור מן סטיית התקן היחסית של 0.51% כי BioSpec ננו ריכוז אמצעים בדיוק - לא רק דנ&quot;א אלא גם חלבונים. הערה 2: גורמים המשפיעים על ריכוז חלבון קביעת ריכוז מדויק של חלבון אפשרית כאשר יש תופעות מינימום מחוסר יציבות הנגרמת על ידי ה-pH, מאגרים, טמפרטורה או תוספים. חלבונים מטוהרים רוב עובר שלבים שונים של עיבוד, ולכן ייתכן כי החלבון עשוי להכיל חומרים פעילי שטח או תוספים אחרים שעשויים להפריע ליצירת טיפה. לקבלת דוגמיות כאלה, באמצעות 5 מ&quot;מ pathlength תא קוורץ מומלץ מאוד. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="איור 1" /> 1. איור אנליטי מבחר חלון quantitation DNA גדילי כפול <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור אנליטי מבחר חלון quantitation ללא חלבון הנקרא <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. נציג נתונים עבור quantitation DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. שחזור נתונים quantitation DNA <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. נציג נתונים עבור quantitation חלבון <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg"alt = &quot;איור 6&quot; /&gt; איור 6. שחזור נתונים עבור quantitation חלבון

<ol>
	<li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1999).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 .</li></ol>

Suja Sukumaran, PhD הוא עובד של Shimadzu שעושה את המכשיר בהשתתפות במאמר זה.

BioSpec-nano תוכנן כדי לפתור את הבעיות הנוכחיות הטמון שיטות quantitation DNA, כגון תוצאות לא עקביות ועל עבודת כפיים מייגעת. מדידת כל לוקח רק 3 שניות, מה שמאפשר ביולוג מולקולרי מנוסה לנתח דגימות מרובות על 3-6 תוך דקה. תכונת מגב ייחודי לא רק משפרת את התפוקה של המדידה, היא גם מבטלת את הצורך בניקוי ידני של כנים, וכתוצאה מכך שריד זניח בין המדידות. יתר על כן, רק 2 בדיקות באמצעות מגבונים עבור דגימות DNA המכיל 1000 ng / μL, ציין שריד פחות מ 2 ng / μL. הזמינות של תא pathlength 5 מ&quot;מ מספק אפשרות לנתח חומצות גרעין לדלל דגימות חלבון, מרחיב את השימוש במכשיר זה עבור יישומים אחרים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BioSpec-nano</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shimadzu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calf Thymus DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume bio-spec nano spectrophotometer

גרעין quantitation נהלים חומצה יש מתקדמות באופן משמעותי בשלושת העשורים האחרונים. יותר ויותר, ביולוגים מולקולריים דורשים ניתוח בקנה אחד קטן בנפח של דגימות חומצות גרעין עבור הניסויים שלהם. BioSpec ננו מספק פתרון אפשרי לבעיות לא מדויק, לא לשחזור תוצאות, הטמון שיטות quantitation הנוכחית DNA, באמצעות האופטיקה המקצועית גלאי PDA רגיש. BioSpec ננו יש גם פונקציונליות אוטומטיות כזו הרכבה, מדידה, ניקוי נעשים על ידי המכשיר, ובכך למנוע השמה משעמם, חוזר על עצמו, וגם לא עקבית של אלמנט סיב אופטי ניקוי ידני. במחקר זה, הנתונים שהוצגו על כימות של דנ&quot;א וחלבונים, כמו גם על שחזור מדידה ודיוק. מגע מדגם אוטומטי לסריקה מהירה מאפשר מדידה תוך שלוש שניות, וכתוצאה מכך תפוקה מעולה. ניתוח הנתונים מבוצע באמצעות תכונות מובנות של התוכנה. הנוסחה המשמשת לחישוב ריכוז ה-DNA הוא: לדוגמא ריכוז = DF ° (OD260-OD320) · NACF (1) איפה DF = דילול מדגם גורם ו NACF = גורם גרעין ריכוז החומצה. גורם גרעין ריכוז חומצה מוגדר בהתאם אנליטי שנבחר 1. ריכוז תוצאות חלבון ניתן לבטא מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​או שומות / L ידי הזנת e280 וערכים משקל מולקולרי בהתאמה. כאשר ערכים שאריות של Tyr, TRP ו - ציסטאין (SS האג&quot;ח) מוזנים בכרטיסיה e280Calc, מקדם את הערכים הכחדה מחושבים e280 = 5,500 x (שאריות TRP) + 1490 x (שאריות Tyr) + 125 x (ציסטאין אס האג&quot;ח) . ערך e280 משמש תוכנה לחישוב ריכוז. בנוסף לקביעת ריכוז של חומצות גרעין וחלבונים, BioSpec ננו יכול לשמש ספקטרופוטומטר מיקרו נפח אולטרה עבור analytes רבים אחרים או ספקטרופוטומטר תקן באמצעות 5 pathlength תאים מ&quot;מ.

Watch this Scientific Journal Video about Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer at JoVE.com

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

תקשורת זה מובאים נתונים על דיוק ועל שחזור של ספקטרופוטומטר UV-VIS BioSpec ננו עבור dsDNA ו quantitation חלבון. אפילו עם כמויות קטנות במיוחד (1 עד 2 ליטר), שחזור מצוין, בעוד פונקציה מנגב אוטומטי משפר את התפוקה ואת התוצאות שריד מינימלי תוצאות מדויקות יותר.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...