Name: concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume bio-spec nano spectrophotometer
Uploaded: 2011-02-17T18:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer at JoVE.com

1. Förfarande för DNA Quantitation <ol><li> Slå på instrumentet. </li><li> Öppna BioSpec-nano-programvaran från datorn skrivbord. </li><li> Klicka på Enkel nukleinsyra-dsDNA fliken (Figur 1). </li><li> Programvaran kommer att upprätta kommunikation med instrumentet och kör en initiering sekvens. Detta verifierar att instrumentet fungerar enligt specifikationerna. </li><li> Välj 0,7 eller 0,2 mm på vägsträckan reglaget. Detta väljer den vägsträckan och alla beräkningar är baserade på den valda vägsträckan. </li><li> Nästa i BioSpec-nano-programvara på Setup-Autowiping setup. Välj 1 eller 2. </li><li> Pipettera 2 mikroliter (för 0,7 mm) H 2 O eller buffert på piedestalen. </li><li> Klicka på tomt eller F6 för tomma mätning. Varje gång en ny sträckenhet väljs är det nödvändigt att spela in en tomt. </li><li> Pipettera 2 mikroliter av provet på piedestalen. </li><li> Klicka på Start i programvaran eller tryck på startknappen på instrumentet. Det övre fönstret går att få kontakt med provet droppen. Xenon blinkar kan observeras. </li><li> Upprepa samma prov 3 gånger för att bestämma reproducerbarheten. </li><li> All inspelad data som sparas som. Knopp-fil. </li><li> För att spara som en. Pdf eller. CSV-fil Klicka på Spara PDF / csv eller F9. Resultaten kan även sparas som en. CSV-fil med hjälp av lämpliga val i fliken Spara. </li></ol> 2. Protokoll för Protein Quantitation <ol><li> Välj fliken Protein Kvantifiering (Figur 2). </li><li> Skriv in E280 extinktionskoefficienten, om den är känd. </li><li> Om E280 inte är känd beräkna den med hjälp e280Calc. </li><li> Välj 0,7 eller 0,2 mm på vägsträckan reglaget. </li><li> Klicka på Setup-Autowiping setup. Välj 2 eller högre. </li><li> Pipettera 3 mikroliter (för 0,2 mm) H 2 O eller buffert på piedestalen. </li><li> Klicka på tomt eller F6 för tomma mätning. </li><li> Pipettera 3 mikroliter av protein prov på piedestalen. </li><li> Klicka på Start i programvaran eller tryck på startknappen på instrumentet. </li><li> Upprepa samma prov 3 gånger för att bestämma reproducerbarheten. </li><li> All inspelad data som sparas som. Knopp-fil </li><li> För att spara som en. Pdf eller. CSV-fil Klicka på Spara PDF / csv eller F9. </li></ol> 3. Representativa resultat: 1. Resultat för DNA Quantitation Figur 3 visar data från mätningar på en typisk dubbelsträngat DNA prov. Koncentrationen och OD 260/280 kvoten beräknas visas också. Figur 4 innehåller resultaten reproducerbara test för DNA-kvantifiering. Uppgifterna i figurerna 3 och 4 visar resultaten är mycket reproducerbara som framgår av det låga relativ standardavvikelse på 0,26%. Anmärkning 1: Felaktighet i DNA-kvantifiering kan uppstå genom närvaron av bufferten komponenter som kan absorbera i UV-området. Det är också nödvändigt att använda en homogen provlösningen. Eftersom mängden provet pipetteras är bara 1-2 mikroliter, noggrann pipettering av korrekta volymer utan införandet av bubblor krävs. 2. Resultat för Protein Quantitation Figur 5 representerar analys proteinkoncentration för BSA. Den mikrogram / ml proteinkoncentration bygger på E280 värde. Figur 6 visar reproducerbarhet analys. Det framgår av den relativa standardavvikelsen på 0,51% att BioSpec-nano åtgärder koncentration exakt - inte bara för DNA utan också för proteiner. Not 2: Faktorer som påverkar proteinkoncentration Exakt koncentration bestämning av protein är möjligt när det finns minst effekterna av instabilitet på grund av pH, buffertar, temperatur, eller tillsatser. De flesta renat protein går igenom olika steg i bearbetningen, och därför är det möjligt att proteinet kan innehålla tensider eller andra tillsatser som kan störa hyalindroppsbildning. För dessa prover, med 5 mm cellen sträckenhet kvarts rekommenderas starkt. <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Analyten val av fönster för dubbelsträngat DNA kvantifiering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Analyten val av fönster för icke märkta proteinet kvantifiering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Representativa uppgifter för DNA-kvantifiering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. Reproducerbarhet uppgifter för DNA-kvantifiering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5. Representativa uppgifter för protein kvantifiering <img src="/files/ftp_upload/2699/2699fig6.jpg"alt = &quot;Figur 6&quot; /&gt; Figur 6. Reproducerbarhet uppgifter för protein kvantifiering

<ol>
	<li>Aisubel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Short Protocols in Molecular Biology. , (1999).</li><li>Pace, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+predict+molar+absorption+coefficient+of+a+protein.">How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Science. 4, 2411-2423 .</li></ol>

Suja Sukumaran är doktorand anställd av Shimadzu som gör instrumentet presenteras i denna artikel.

Den BioSpec-nano har utvecklats för att lösa aktuella frågor som ingår i DNA-kvantifiering, såsom inkonsekventa resultat och tidskrävande manuellt arbete. Varje mätning tar bara 3 sekunder, vilket gör att en erfaren molekylärbiolog att analysera ca 3-6 flera prover i en minut. Den unika torkar funktion som inte bara förbättrar genomströmning av mätning, den eliminerar också behovet av manuell rengöring av piedestaler, vilket resulterar i försumbar överföring mellan mätningarna. Vidare uppgav tester med bara 2 våtservetter för DNA-prover som innehåller 1000 ng / mikroliter, överföring mindre än 2 ng / mikroliter. Tillgången till ett 5 mm sträckenhet cell ger en möjlighet att analysera späda nukleinsyra och prover protein och utökar användningen av detta instrument för andra applikationer.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>BioSpec-nano</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shimadzu</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calf Thymus DNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume bio-spec nano spectrophotometer

Nukleinsyra kvantifiering förfaranden har avancerat kraftigt under de senaste tre decennierna. Fler och fler, molekylärbiologer kräver konsekvent små volymer analys av nukleinsyra prover för sina experiment. Den BioSpec-nano ger en möjlig lösning på problemen med felaktiga, icke reproducerbara resultat inneboende i dagens DNA-kvantifiering, via specialiserade optik och en känslig PDA detektor. Den BioSpec-nano har också automatiserade funktioner så att montering, mätning och städning görs av instrumentet, och därmed eliminera tråkiga, repetitiva och inkonsekvent placering av fiberoptiska element och manuell rengöring. I denna studie har data som presenteras på kvantifiering av DNA och protein, samt på mätning reproducerbarhet och noggrannhet. Automatiserad prov kontakt och snabb scanning gör att mätning i tre sekunder, vilket ger en utmärkt genomströmning. Dataanalys utförs med hjälp av den inbyggda funktioner i programvaran. Den formel som används för beräkning av DNA-koncentrationen är: Exempel Koncentration = DF · (OD260-OD320) · NACF (1) Där DF = faktor provspädning och NACF = nukleinsyra koncentration faktor. Nukleinsyran koncentrationsfaktor är satt i enlighet med analyten vald 1. Protein koncentration resultat kan uttryckas som mikrogram / ml eller som mol / l genom att ange E280 och molekylära värden vikt respektive. När rester värden för Tyr, trp och cystein (SS bond) förs in i e280Calc fliken är extinktionskoefficienten värden beräknas enligt E280 = 5500 x (Trp rester) + 1490 x (Tyr rester) + 125 x (cystein SS bond) . Det E280 Värdet används av programvaran för koncentrationen beräkning. Förutom att koncentrationen bestämning av nukleinsyror och protein, kan BioSpec-nano kan användas som en Ultra Micro-volym spektrofotometer för många andra analyter eller som en vanlig spektrofotometer med 5 celler mm vägsträckan.

Watch this Scientific Journal Video about Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer at JoVE.com

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Detta meddelande innehåller uppgifter om noggrannheten och reproducerbarheten av BioSpec-nano UV-VIS spektrofotometer för dsDNA och protein kvantifiering. Även med extremt små volymer (1 till 2 L), är reproducerbarheten utmärkt, medan den automatiserade torka funktion förbättrar genomströmning och ger minimal överföring för mer exakt resultat.

Koncentration Fastställande av nukleinsyror och proteiner med hjälp av Micro-volymen Bio-spec Nano Spektrofotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume proteinkoncentration Fastställande med NanoDrop 2000C Spektrofotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Kvantifiering av dsDNA med Hitachi F-7000 Fluorescens Spektrofotometer och PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Microvolume Kvantifiering av nukleinsyror

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysera och bygga nukleinsyrastrukturer med 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvensspecifik Märkning av nukleinsyror och proteiner med metyltransferaser och kofaktor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

Återstod specifika Införande av Noncanonical aminosyror i modellproteiner Använda en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellfritt Transkription-översättning System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyror: En enkel och snabb DNA-extraktion metod

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Bestämning av sialinsyror i lever och mjölkprover av vildtyp och<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out-möss.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...