Name: polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00
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Forschung in der Sokol-Labor wird von der National Institues of Health gefördert.

1. In-Vitro-Fertilisation von Xenopus Eier <ol><li> Erhalten Eier von weiblichen Frösche, die mit humanem Chorion-Gonadotropin (400 Einheiten / Frosch) 12 Stunden vor dem Experiment wurden injiziert. </li><li> Die Eier in eine kleine Menge (0.5-1 ml) von 1 geändert Ringer x Marc-Lösung (MMR) 10, um die Eier und befruchtet sie in vitro mit einem kleinen Stück seziert Hoden. Nach 2-3 min, fügen Sie 0,1 x MMR auf die gesamte Oberfläche der Eier zu decken. HCL (eingestellt auf p...

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	<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction+---+molecular+aspects.">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Developmental Genetics. , (2007).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+in+development+and+disease.">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li><li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer.">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li><li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling:+multiple+pathways,+multiple+receptors,+and+multiple+transcription+factors.">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li><li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt/JNK+signaling.">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li><li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development.">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li><li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling.">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li><li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development.">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li><li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt/beta-catenin+signaling.">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li></ol>

Wir haben die oben genannten Protokoll verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung von Diversin charakterisieren. In animalen Pol Explantate wurde Diversin-RFP neben dem Zellkern und erkannt Kolokalisation mit g-Tubulin, ein zentrosomale Marker, in Gefrierschnitten (Abbildung 1). Sobald die subzelluläre Lokalisierung eines Proteins identifiziert ist, kann das Löschen Konstrukte erzeugt werden, um festzustellen, welche Proteindomänen notwendig und ausreichend für die subzelluläre Lokalisation sind. Mit diesem Ansa...

polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling

Zellpolarität ist eine fundamentale Eigenschaft von eukaryotischen Zellen, die dynamisch von beiden innerer und äußerer Faktoren ist während der embryonalen Entwicklung 1, 2 geregelt. Einer der Signalwege in dieser Regelung beteiligt ist, des Wnt-Signalwegs, der oft verwendet wird während der Embryogenese und entscheidend für die menschliche Krankheit 3, 4, 5. Mehrere molekularen Komponenten dieses Signalwegs koordinativ regulieren Signalisierung in einem räumlich eingeschränkten Weise, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig verstanden. Xenopus embryonalen Epithelzellen ist ein ausgezeichnetes System zur subzellulären Lokalisation verschiedener Signalproteine ​​zu studieren. Fluorescent Fusionsproteine ​​in Xenopus Embryonen, die durch RNA Mikroinjektion ausgedrückt sind, ektodermalen Explantate vorbereitet und Proteinlokalisierung wird durch Epifluoreszenz ausgewertet. In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir, wie subzelluläre Lokalisierung von Diversin, eine zytoplasmatische Protein, das in Signal-und Zellpolarität Bestimmung 6, 7 eine Rolle spielt visualisiert in Xenopus ektodermalen Zellen Wnt Signaltransduktion 8-Studie ist. Coexpression eines Wnt-Liganden oder ein Frizzled-Rezeptor verändert die Verteilung von Diversin mit rot fluoreszierendes Protein, RFP fusioniert und Rekruten an die Zellmembran in einer polarisierten Mode 8, 9. Diese ex vivo-Protokoll soll eine sinnvolle Ergänzung zur in vitro-Studien von kultivierten Säugetierzellen, in denen räumliche Steuerung der Signalisierung unterscheidet sich von dem intakten Gewebe und ist sehr viel schwieriger zu analysieren.

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Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonalen Ektoderm hat sich ein attraktives Modell für Studien der Zellpolarität. Ein Assay ist beschrieben, in denen subzellulären Verteilung von fluoreszierenden Proteinen in Ectodermzellen beurteilt wird. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, Fragen im Zusammenhang mit räumlichen Steuerung der Signalisierung.

Polarized Translokation von fluoreszierenden Proteinen in Xenopus Ektoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Forschung

Biologie

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...