Name: polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00
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La ricerca nel laboratorio Sokol è patrocinata dal Institues Nazionale di Salute.

1. Fecondazione in vitro di uova di Xenopus <ol><li> Ottenere le uova da rane femminile che sono stati iniettati con gonadotropina corionica umana (400 unità / rana) 12 ore prima dell&#39;esperimento. </li><li> Mettere le uova in una piccola quantità (0.5-1 ml) di soluzione 1 x Marc Ringer modificati (MMR) 10 per le uova e fecondare in vitro con un piccolo pezzo di testicolo sezionato. Dopo 2-3 minuti, aggiungere 0,1 x MMR per coprire tutta la superficie delle uova. In 20 minuti...

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	<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction+---+molecular+aspects.">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Developmental Genetics. , (2007).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+in+development+and+disease.">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li><li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer.">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li><li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling:+multiple+pathways,+multiple+receptors,+and+multiple+transcription+factors.">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li><li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt/JNK+signaling.">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li><li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development.">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li><li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling.">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li><li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development.">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li><li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt/beta-catenin+signaling.">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li></ol>

Abbiamo usato il protocollo di cui sopra per caratterizzare la localizzazione subcellulare di Diversin. In espianti polo animale, Diversin-RFP è stata rilevata accanto al nucleo e colocalized con g-tubulina, un marker centrosomica, in criosezioni (Figura 1). Una volta che la localizzazione subcellulare di una proteina è identificato, costruisce la cancellazione può essere generata per stabilire quali domini di proteine ​​sono necessarie e sufficienti per la localizzazione subcellulare. Usando questo approccio, i ...

polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling

Polarità delle cellule è una proprietà fondamentale delle cellule eucariotiche che viene dinamicamente regolato da fattori intrinseci ed estrinseci, sia durante lo sviluppo embrionale 1, 2. Una delle vie di segnalazione coinvolte nel presente regolamento è la via Wnt, che viene utilizzato più volte durante l&#39;embriogenesi e critica per la malattia umana 3, 4, 5. Molteplici componenti molecolari di questa via di segnalazione coordinatamente regolano in maniera spazialmente limitato, ma i meccanismi alla base non sono pienamente compresi. Xenopus cellule embrionali epiteliali è un ottimo sistema per studiare la localizzazione subcellulare delle diverse proteine ​​di segnalazione. Proteine ​​di fusione fluorescenti sono espressi in embrioni di Xenopus da microiniezione di RNA, gli espianti ectodermiche sono preparati e la localizzazione delle proteine ​​viene valutato epifluorescenza. In questo protocollo sperimentale descriviamo come localizzazione subcellulare di Diversin, una proteina citoplasmatica che è stato implicato nella segnalazione e polarità determinazione delle cellule 6, 7 viene visualizzato in Xenopus cellule ectodermiche per lo studio di trasduzione del segnale Wnt 8. Coespressione di un ligando Wnt o un recettore Frizzled altera la distribuzione di Diversin fuse con il rosso proteina fluorescente, RFP, e reclute alla membrana cellulare in maniera polarizzata 8, 9. Questo protocollo ex vivo dovrebbe essere un&#39;utile aggiunta a studi in vitro su colture di cellule di mammifero, in cui il controllo spaziale del segnale è diversa da quella del tessuto intatto ed è molto più difficile da analizzare.

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Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

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Biologia

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

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The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

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Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

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Quantificazione di orofacciale fenotipi in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus in risposta alla segnalazione Wnt

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