Name: polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling
Uploaded: 2011-05-26T15:00:00
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Pesquisa no laboratório Sokol é patrocinado pela Institues Nacional de Saúde.

1. Fertilização In Vitro de Xenopus Ovos <ol><li> Obtenção dos ovos de rãs do sexo feminino que foram injetados com gonadotrofina coriônica humana (400 unidades / rã) 12 horas antes do experimento. </li><li> Coloque os ovos em uma pequena quantidade (0,5-1 ml) de uma solução de Ringer x Marc modificados (MMR) 10 a os ovos e fertilizá-los in vitro com um pequeno pedaço de testículos dissecados. Depois de 2-3 min, adicione 0,1 x MMR para cobrir toda a superfície dos ovo...

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	<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+induction+---+molecular+aspects.">Embryonic induction --- molecular aspects.</a> Development. 99, 285-306 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Developmental Genetics. , (2007).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+in+development+and+disease.">Wnt/beta-catenin signaling in development and disease.</a> Cell. 127, 469-480 (2006).</li><li>Klaus, A., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+and+its+impact+on+development+and+cancer.">Wnt signalling and its impact on development and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 8, 387-398 (2008).</li><li>Gordon, M. D., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling:+multiple+pathways,+multiple+receptors,+and+multiple+transcription+factors.">Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.</a> J Biol Chem. 281, 22429-22433 (2006).</li><li>Schwarz-Romond, T., Asbrand, C., Bakkers, J., Kuhl, M., Schaeffer, H. J., Huelsken, J., Behrens, J., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ankyrin+repeat+protein+Diversin+recruits+Casein+kinase+Iepsilon+to+the+beta-catenin+degradation+complex+and+acts+in+both+canonical+Wnt+and+Wnt/JNK+signaling.">The ankyrin repeat protein Diversin recruits Casein kinase Iepsilon to the beta-catenin degradation complex and acts in both canonical Wnt and Wnt/JNK signaling.</a> Genes Dev. 16, 2073-2084 (2002).</li><li>Moeller, H., Jenny, A., Schaeffer, H. J., Schwarz-Romond, T., Mlodzik, M., Hammerschmidt, M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversin+regulates+heart+formation+and+gastrulation+movements+in+development.">Diversin regulates heart formation and gastrulation movements in development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 15900-15905 (2006).</li><li>Itoh, K., Jenny, A., Mlodzik, M., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+localization+of+Diversin+and+its+relevance+to+Wnt+signaling.">Centrosomal localization of Diversin and its relevance to Wnt signaling.</a> J. Cell Sci. 122, 3791-3798 (2009).</li><li>Itoh, K., Jacob, J., Sokol, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Xenopus+Frizzled+8+in+dorsal+development.">A role for Xenopus Frizzled 8 in dorsal development.</a> Mech Dev. 74, 145-157 (1998).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30, 675-686 (1982).</li><li>Itoh, K., Brott, B. K., Bae, G. U., Ratcliffe, M. J., Sokol, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+is+required+for+Dishevelled+function+in+Wnt/beta-catenin+signaling.">Nuclear localization is required for Dishevelled function in Wnt/beta-catenin signaling.</a> J Biol. 4, 3-3 (2005).</li></ol>

Temos utilizado o protocolo acima para caracterizar a localização subcelular de Diversin. Em explantes pólo animal, Diversin-RFP foi detectado junto ao núcleo e colocalized com g-tubulina, um marcador centrosomal, em criosecções (Figura 1). Uma vez que a localização subcelular de uma proteína é identificada, constrói a exclusão pode ser gerado para estabelecer quais domínios de proteína são necessárias e suficientes para a localização subcelular. Usando essa abordagem, os domínios de localização cen...

polarized translocation of fluorescent proteins in xenopus ectoderm in response to wnt signaling

Polaridade celular é uma propriedade fundamental das células eucarióticas que é dinamicamente regulada por fatores intrínsecos e extrínsecos durante o desenvolvimento embrionário 1, 2. Uma das vias de sinalização envolvidas neste regulamento é o caminho Wnt, que é usado muitas vezes durante a embriogênese e críticas para a doença humana 3, 4, 5. Múltiplos componentes moleculares desta via coordenadamente regular a sinalização de uma forma espacialmente restrito, mas os mecanismos subjacentes não são totalmente compreendidos. Células embrionárias epiteliais Xenopus é um excelente sistema para o estudo de localização subcelular de várias proteínas de sinalização. Proteínas de fusão fluorescentes são expressos em embriões Xenopus por microinjeção RNA, explantes ectodérmica são preparados e localização de proteínas é avaliado por epifluorescência. Neste protocolo experimental que descrevem como localização subcelular de Diversin, uma proteína citoplasmática que tem sido implicado na sinalização celular e determinação de polaridade 6, 7 é visualizado em células Xenopus ectodérmica para estudar transdução de sinal Wnt 8. Co-expressão de um ligante Wnt ou um receptor Frizzled altera a distribuição de Diversin fundido com proteína fluorescente vermelha, RFP, e recruta-o para a membrana celular de uma forma polarizada 8, 9. Este protocolo ex vivo deve ser uma adição útil para estudos in vitro de culturas de células de mamíferos, em que o controle espacial de sinalização difere daquela do tecido intacto e é muito mais difícil de analisar.

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Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus ectoderma embrionário tornou-se um modelo atraente para os estudos da polaridade celular. Um ensaio é descrito, em que a distribuição subcelular de proteínas fluorescentes é avaliada em células ectoderma. Este protocolo vai ajudar abordar as questões relacionadas ao controle espacial de sinalização.

Translocação polarizada de proteínas fluorescentes em Xenopus Ectodérmicas em resposta à sinalização Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Biologia

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Fotoconversão de proteínas purificadas fluorescentes e Dual-sonda Destacando Optical em células vivas

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

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Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

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The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

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Reconstituição da degradação de β-catenina em extrato de ovo de Xenopus

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

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Quantificação de Orofacial nos fenótipos<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...