Name: determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00
Duration: 9 min 56 s
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यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (K22NS050137 जेसीबी) के द्वारा समर्थित किया गया था.

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	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम एक कदम-by-कदम का वर्णन कैसे चूहे cortical फ्लोरोसेंट संकेतक TMRM और 2 एच डीसीएफ डीए, क्रमशः का उपयोग कर न्यूरॉन्स में ΔΨm और ROS निर्धारित करने के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत किया है. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए, यह महत्वपूर्ण है empirically अंतिम लोड हो रहा है और TMRM या एच 2 डीसीएफ डीए के लिए समय एकाग्रता का निर्धारण. सामान्य में, 20-200 एनएम से TMRM सांद्रता रेंज, और TMRM के साथ सेल ऊष्मायन समय 20 से 60 मिनट के लिए बदलता है. 2 एच के अंतिम डीसीएफ डीए एकाग्रता 2-10 सुक्ष्ममापी से पर्वतमाला है, और एक लोड हो रहा है इस सूचक युक्त समाधान में कोशिकाओं के ऊष्मायन 30-45 मिनट से भिन्न होता है है. यह लेजर और छवियों को लेने के लिए कोशिकाओं प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन (TMRM प्रतिदीप्ति की चंचल उदाहरण के लिए) और किसी भी प्रोत्साहन के अभाव में दोनों फोटो विषाक्तता से बचने के स्कैन गति, शक्ति का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. अनुकूलित ऑप्टिकल सेटिंग्स एक प्रतिदीप्ति संकेत है कि अधिक या कम संतृप्त (दहलीज) उत्तेजना के अभाव में नहीं है में परिणाम चाहिए. एक विशेष लेजर शक्ति और एक स्कैन गति पर एक चयनित क्षेत्र से छवियों को इकट्ठा करने के लिए इष्टतम स्थितियों जब वहाँ रहते इमेजिंग के 10-15 मिनट के लिए किसी भी प्रोत्साहन के अभाव में जांच के प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई बदलाव नहीं कर रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं. अन्य प्रतिदीप्ति ΔΨm निर्धारित जांच rhodamine 123 और टेट्रा मिथाइल rhodamine एथिल एस्टर (TMRE) शामिल हैं. हालांकि, वे पृथक mitochondria 2 में श्वसन प्रक्रिया को बाधित पाया गया . महत्वपूर्ण बात, TMRM कम 2 सांद्रता में mitochondrial श्वसन पर कोई प्रभाव नहीं है और कम phototoxicity और अन्य जांच के साथ तुलना में 3 photobleaching है . एच डीसीएफ डीए 2 ROS के लिए एक अच्छा संकेत है, क्योंकि यह अच्छी तरह से कोशिकाओं में बनाए रखा है और कई ऑक्सीडेंट प्रजातियों peroxides रूप में, सुपर आक्साइड, और नाइट्रिक ऑक्साइड 4 पहचानता है.

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक के नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th></tr><tr><td> ग्लास नीचे संस्कृति पकवान </td><td> MatTek निगम </td><td> P35G 1.5-14 - सी </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> एच डीसीएफ डीए 2 </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> सिग्मा </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> सिग्मा </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 हे </td><td> सिग्मा </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> 2 MgCl • 6 2 हे </td><td> सिग्मा </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> डी ग्लुकोज </td><td> सिग्मा </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

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Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

हम प्रतिदीप्ति सूचक, TMRM के आवेदन का प्रदर्शन, cortical न्यूरॉन्स के लिए एक विशेष प्रोत्साहन के आवेदन से पहले और बाद में TMRM प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन सापेक्ष निर्धारित. हम भी प्रतिदीप्ति जांच एच के आवेदन शो<sub2&gt;</sub&gt; Cortical न्यूरॉन्स में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के रिश्तेदार स्तर का आकलन DCF-महंगाई भत्ते.

लाइव चूहा cortical न्यूरॉन्स में mitochondrial झिल्ली संभावित और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के निर्धारण

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

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To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स एफएम रंगों का उपयोग करने में Synaptic पुटिका पूल पुनःपूर्ति के मात्रात्मक विश्लेषण

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स और Glia Bilaminar सह संस्कृति

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

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In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Vivo में दो photon इमेजिंग cortical न्यूरॉन्स में अनुभव पर निर्भर आणविक परिवर्तन

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

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झिल्ली वयस्क चूहों से ventromedial Hypothalamus न्यूरॉन्स की संभावित डाई इमेजिंग ग्लूकोज सेंसिंग अध्ययन करने के लिए

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

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चूहा cortical न्यूरॉन्स में filamentous actin (एफ actin) puncta की मात्रा

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

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वीवो में नवजात चूहों में Cortical न्यूरॉन्स की दो-फोटॉन इमेजिंग

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