Name: in vivo laser axotomy in c. elegans
Uploaded: 2011-05-19T12:00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vivo Laser Axotomy in C. elegans at JoVE.com

Arbetet i Hammarlund labbet är finansierat av: NIH bidrag R01 NS066082-01 och T32GM007223, Beckman Foundation och Ellison Medical Foundation.

1. Montering av systemet De specifika komponenterna i vårt system beskrivs nedan. När korrekt monterad, ska användaren kunna fokusera mikroskop med ena handen, flytta scenen med de andra (antingen med musen eller joysticken), aktivera lasern med hjälp av fotpedalen och har en tydlig bild av om- skärmbilden. <ol><li> MicroPoint laser monterad på den epi-fluorescens-port av ett sammansatt mikroskop. Vi använder en Nikon 80i, men någon forskning-grade upprätt eller inverterat omfattning bör fungera. Det MicroPoint Systemet kommer att innehålla en anpassad dikroiska, som ska matcha fluoroforen att etiketterna de celler som du vill klippa. Kapning celler märkta med alternativa fluoroforer kräver ytterligare dichroics. Dessutom en pulsgenerator och fotpedal levereras med MicroPoint systemet. </li><li> 100x, 1,4 NA olja mål för att utföra kirurgi och bedöma förnyelse, plus ytterligare mål som krävs för att hitta prov på bilden. Vi använder en Nikon Plan Apo VC för kirurgi, och finner att en 4x är användbart för grov fokusera och hitta provet. </li><li> Motoriserad scen med joystick. En scen med extremt hög noggrannhet och repeterbarhet är onödigt, eftersom scenen används endast för inriktning. Vi använder en Prior OptiScan II (se diskussion). </li><li> Kamera. Kameran måste ge en bildhastighet tillräckligt att fokusera och rikta den märkta neurite med 100x mål, medan du visualiserar bilden på datorskärmen. Vi föredrar dämpa belysningen ljus under axotomy förfarande för att undvika eventuella felkällor effekter från foto-blekning eller skada (se 1.7, nedan). Därför måste kameran vara känsliga nog att rymma denna sänkta ljusnivå. Vi använder en Hamamatsu Orca 05G, och upptäcker att avbildning vid 16,3 Hz är tillräcklig. Motsvarande kameror kan ersätta. </li><li> Dator, bildskärm och bildbehandlingsprogram som kan driva kameran. Dessutom använder vi bildbehandlingsprogram för att manipulera motoriserade scenen med en mus (se diskussion). </li><li> Air bord. Detta krav kan variera beroende på plats, men eftersom operationen utförs med en 100x mål, vi hittar vibrationsisolering vara nödvändigt. </li><li> Ljus försörjning med ljus guide och slutare mekanism för att belysa fluoroforen. Ljuset guiden kommer att lägga till MicroPoint. Slutaren Mekanismen är användbar för att minska belysningen intensiteten oberoende av laser. Vi använder en Före Lumen 200 eller en Leica EL6000 och dämpa upp till 80% av det totala ljusintensitet för axotomy. </li></ol> 2. Laser installation Ett detaljerat protokoll för att initialt rikta och fokusera lasern är försedd med MicroPoint lasersystem. Vi antar att proceduren har följts framgångsrikt vid första installationen. Detta inkluderar att rikta lasern med hårkorset i okularet. Här ger vi ett protokoll för regelbundet underhåll av laser fokus och intensitet. Som påpekas i MicroPoint manualen är pulsad kväve laser som kan allvarligt skada det mänskliga ögat. Försiktighet bör vidtas för att aldrig titta direkt in i laserstrålen. En gång installerat, bör spärrfilter blocket säkert strålning genom okularen. Kapning nervceller i en organism storleken på ett sandkorn kan vara en utmaning. Eftersom området skador som lasern är mycket liten, är det viktigt att känna till tredimensionella platsen för laser fokus för att rikta provet exakt. Lasern fokus hittas med hjälp av speglade bilden. Först kontrollerar vi att z platsen för laser fokus matchar fokus för avbildning vägen. Därefter är xy platsen för skadan fokus markerade med hårkorset i bildprogram. Fokusera i z-planet <ol><li> Tryck in filter med neutral densitet ND16 (Figur 1a). Vi använder neutral densitet filter i epi-belysning väg att dämpa lasern samtidigt som fokus. För ännu finare fokus, tryck i både ND16 och ND4 fluorescerande filter. </li><li> Ställ MicroPoint laser för att en puls med övergången vände sig till &quot;Välj&quot; (Figur 1b) och sedan flytta filtret hjulet till rätt lång-pass-spärrfilter (Figur 1c). </li><li> Placera speglade bilden på scenen och fokusera på hål i den med 4X målet med hjälp av ljus. </li><li> Tillsätt en droppe immersionsolja att de speglade bilden och fokusera på hål med 100X målet. Öppna kamerans slutare med den optiska väglängden byta spaken (Figur 1d) och laser slutaren (Figur 1e). Om det behövs, minskar överförs ljusstyrkan så att kanterna på hål är klara: detta kommer att hjälpa att fokusera exakt. </li><li> Tryck på fotpedalen. Detta borde innebära ett litet hål i spegeln om lasern är fokuserad på rätt sätt. </li><li> Fokusera mikroskop något över plan speglade bilden och skjuta laser igen. Detta bör göra en ännu mindrehål än det första skottet, eller lämna något märke alls. Upprepa genom att fokusera under speglade bilden. </li><li> Om ett hål inte produceras i 2,5, eller om ett större hål bildas när fokus över eller under ytan på spegeln, fokusera lasern med fokusringen på ablation huvudet. Kontrollera att hålet fortfarande är korrekt i linje med hårkorset i okularet. Med konsekvent användning behöver z-planet fokus sällan justeras. </li></ol> Fokusera i XY-planet <ol start="8"><li> Följ steg 2,1 med 2,3 ovan och tryck på fotpedalen för att göra ett litet hål i spegeln bilden. </li><li> Initiera &#39;Live&#39; infångningsläge på Element &quot;Hämta&quot;-menyn. I &quot;Mät&quot; verktygsraden väljer du &quot;ROI redaktör&quot;, välj sedan &quot;dubbel korset&quot; verktyg och dra hårkorset att anpassa dem till centrum för det nya hålet. Klicka på &quot;Spara ROI&quot; och sedan &quot;Avsluta redigerare&quot; och återuppta Live infångningsläge. </li><li> Aktivera &quot;musen XY&quot; inställning i Elements för att manipulera scenen med musen. </li><li> Dra filter med neutral densitet (s) tillbaka till den ursprungliga positionen (s), ställ in laserpulser till 10, och ta bort den speglade bilden. </li></ol> Justering av kraften av laser <ol start="12"><li> Styrkan i lasern ska anpassas till minsta möjliga ström för att skära av neuron som du väljer. Justera makten genom att flytta dämparen plattan (Figur 1f) samtidigt minska levande maskar (beskrivs nedan). Om lasern strömmen är för hög, kommer det att orsaka perifer skada eller spränga ett hål i masken. Om lasern strömmen är för låg, kommer det att kapa inte neuron. När systemet har satts upp, behöver dämpare ställning sällan ändras. Om lasern blir svag, och dämparen plattan behöver flyttas för att fortsätta klippa, kan det vara ett tecken på att färgen på färgen cellen behöver bytas ut (se diskussion). </li></ol> 3. Immobilisera maskar <ol><li> Bered en lösning på 3% smälta agarosen i M9 (22mm KH2PO4, 42mm Na2HPO4, 85mm NaCl, 1mm MgSO4). Tillsätt 5 ml av smält agaros i en 15 ml Falcon rör. Fyll ett annat rör med vatten. Placera rören i ett modulärt värmeelement satt till 55 ° C. Fyll värmeelement med vatten för att skapa mini vattenbad för varje rör. Obs: Agarosen kan förberedas i stora mängder i förväg och åter smälte för senare experiment. </li><li> Placera två skikt märkning tejp på vardera av två bilder och en ren bild mellan dessa bilder. Tillsätt en droppe agaros hjälp av en plast glödlampa pipett till mitten av den rena bilden och placera en annan bild vinkelrätt mot den första så att den resulterande agarosen pad är tjockleken på två bitar av band (figur 2). Ta en av de två bilderna från plattan efter 30 sekunder. Skölj och lagra plastpipetten i vattenfyllda falk rör för användning med efterföljande bilder. </li><li> Placera 3-5 mikroliter av 0,10 ìm eller 0,05 ìm pärlor polystyren i mitten av plattan. Lägg 5-10 maskar uttrycka fluorescerande protein i nervceller av intresse. Om nervceller av intresse är asymmetriskt fördelad på höger eller vänster sida av masken, använd en platina pick att vända maskar så att rätt sida är uppåt. Worms måste placeras på bilderna inom 10 minuter att förbereda agarosen kuddar. </li><li> Placera försiktigt ett täckglas på maskar. Efter att locket glida, inte flytta det i förhållande till agaros pad eftersom detta kommer att störa nagelband och förstöra maskar. Placera den förberedda glida på mikroskop scenen. </li></ol> 4. Klipp nervceller <ol><li> Direkt ljus i okularet med den optiska väglängden byta spaken. Fokus på masken sänkas med 4X målet, placera en droppe olja på omslaget slip, och växla till 100X målet. Återgå den optiska väglängden till kameran. </li><li> Använd musen för att flytta neuron som du valt under mitten av hårkorset. Tryck på fotpedalen för att avfyra laser och skilja de neuronala processen. Vid behov kan två pulser användas för att kapa de neuron. Till en början är det bra att spåra exakt vilka nervceller har sönderfallit i enskilda maskar för att bedöma kommande förnyelse. När utförs korrekt, producerar laser axotomy en liten paus i neuron utan att orsaka betydande skador på omgivande hud vävnad eller andra nervceller (se figur 3). I vissa fall kan ett litet ärr bildas runt platsen för skadan. </li><li> Återvinn maskar genom att ta bort locket glida i en direkt uppåtriktad rörelse, var noga med att maskar kvar på agarosen pad. Skjut inte täckglas av. Sedan sänkte pad runt maskar med nål-näsa tång och placera den del av agarosen på en nyligen seedade NGM skylt som innehåller OP50 8. Plats 10 mikroliter steril M9 på plattan att befria maskar från pärlorna och ta bort agaros. </li></ol> 5. Betyg nervceller för förnyelse <ol><li> Förbered agarosen pad som beskrivs i steg 2,2. </li><li> Placera maskar i 3-5 &amp;mu, L av polystyren pärlor. Lägg på ett täckglas. Diabilder kan förberedas sekventiellt, alternativt alla maskar kan förberedas i förväg och bilderna förvaras i 10 rätter cm kultur, var och en innehåller en fuktig Kimwipe att hålla agaros fuktig. </li><li> Använd 100X syftet att visualisera avskurna nervceller. I många nervceller kommer en neuronal stubbe distalt om skära platsen kvar. Vi använder förekomsten av detta rest som en indikation på att neuron verkligen var avhuggna (Figur 4). Förekomsten av denna stump gör det möjligt att urskilja en neuron som har beskurits och återvunna från en som inte klipptes. Observera: både distala och proximala stubbar initialt tillbaka efter beskärning. </li><li> Bedöm förnyelse. En mängd olika parametrar kan bestämmas. Ett enkelt test är om den skadade neuron har bildat en tillväxt kotte (Figur 4a) och regenereras eller inte (figur 4b). Alternativt kan neurite längd spåras och jämföras. </li></ol> 6. Representativa resultat Som exempel beskriver vi karakterisering av förnyelse av γ-aminosmörsyra (GABA) motoriska nervceller. Dessa nervceller, som bor i ventrala nerv sladden och förlänga processer runt om, med rygg-nerven sladden, är avgörande för korrekt förflyttning 9. GABA nervceller kan visualiseras genom att uttrycka en genetiskt kodade fluoroforen, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), under kontroll av UNC -47 eller UNC -25 projektansvariga (stammar EG1285 och CZ1200 respektive erhållas från C. elegans Genetiska Center ). Mount L4-stadium maskar som beskrivs, flip maskarna så att GABA nervceller på deras högra sidor är vänd uppåt och placera locket halka. Skär 1-3 av den bakre commissures i varje mask, halvvägs mellan rygg-och ventrala sladdar. Undvik att skära commissures som korsar eller fasciculate med andra commissures, eftersom dessa är svåra att göra mål senare. Återhämta maskar som beskrivs. 18 till 24 timmar efter en lyckad axotomy kommer maskarna har återhämtat sig från operationen och uppvisar normalt motoriskt och äggläggning beteenden. Släng maskar som är döda eller sjuka. Montera resten som beskrivs, och bedöma förnyelse. Vi strävar oftast att bedöma minst 30 skära neuroner per experimentella skick. I oxIs12 djur, normalt 60-70% av avskurna L4 GABA nervceller har inlett en struktur tillväxt kon, framgår av en breddning av membran vid spetsen och förlängningen av flera neurite grenar, och flyttade från den skurna plats (Figur 4a). I många fall kommer tillväxten kottar har migrerat att återansluta med rygg-nerv sladd, en intilliggande neuronala commissure, eller den distala stumpen. Resterande 30% av nervceller har antingen inlett ingen tillväxt, bilda en stubbe proximalt platsen för axotomy eller kommer att ha förlängd små filopodia (Figur 4b). <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Figur 1"/> Figur 1. UV pulsad laser axotomy system. Specifika komponenter är: (a) ND-filter (b) puls väljaren (c) filterhjul spaken (d) optiska väglängden byta spaken (e) lasern slutare och (f) dämpare plattan. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Figur 2"/> Figur 2. Förbereda en agaros pad. Att förbereda ett agarosen pad i önskad tjocklek, (grön) två lager tejp är placerade på två bilder. En bild är placerad mellan de två första, och en droppe agaros läggs sedan till den rena bilden. Slutligen finns en fjärde bild placeras vinkelrätt mot de tre första, vilket resulterar i en pad som är tjockleken på två bitar av tejp. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Figur 3"/> Figur 3. Representant GABA neuron axotomies. I ett typiskt experiment är GABA neuron commissures avskiljes vid mitten av laterala delen av masken. En avskuren commissure visas omedelbart före (vänster) och efter (höger panel) axotomy. Alla bilder tagna med ett 100X olja mål. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Figur 4"/> Figur 4. Representativa resultat av GABA neuron axotomies. 24 tim efter axotomy avhuggna axoner poängsätts för regenerering. En regenererande axonet med en tillväxt kon (pil) visas i (a), medan en icke-regenererande axonet ses som en proximal stubbe (pil) i (B). Distala stumpen av varje snitt Axon visas i varje panel (pilspets) och är en indikation på att axonet har brutit.

<ol>
	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branchi+ng.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration.">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+Functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans.">The Nematode Caenorhabditis Elegans.</a> , (1988).</li><li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li><li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies.">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science &#38; Processing. 96, 335-341 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology.">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , (2010).</li><li>Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAX-1,+a+Novel+PH/MyTH4/FERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion.">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li><li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter.">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .</li><li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization,+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation.">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution.">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li><li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration.">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

En mängd olika lasersystem har använts för att skära neurites i C. elegans, och flera studier har undersökt sina resultat i detalj 3,7,10,11. Den MicroPoint laser som används i våra protokoll är ett nyckelfärdigt system som är enkelt att installera och underhålla, och är tillgänglig till en låg kostnad för forskare jämfört med en Ti-Safir lasersystem. Jämfört med en Ti-Safir system är dock MicroPoint laser förväntas orsaka skador på en större yta, vilket kan vara till nackdel för vissa tillämpningar. Om en Ti-Safir-system är önskvärt, är ett utmärkt protokoll på att bygga ett sådant system finns 12. Den nuvarande protokollet kan utföras på en mängd olika nervceller i C. elegans, men noterar vi att skillnader i regenerativ förmåga mellan olika typer av nervceller väntas 13. Dessutom kan olika transgena bakgrunder påverkar regenerativ framgång. Även andelen regenererande GABA nervceller är ganska konsekvent mellan olika transgena markör stammar har vi noterat en total viss ökning av förnyelse i juIs76 14 vs oxIs12 15 maskar. Skillnader mellan markörer vid beröring nervceller har också beskrivits 2. Vi föredrar att immobilisera maskar med mikrokulor snarare än bedövningsmedel som pärlor resultera i snabbare och mer konsekvent immobilisering 16. Detta är också en fördel som vi kan iaktta förnyelse utan eventuella confounding effekter till följd av anestesi 17. Ett alternativ anestesi-fri metod för fixering är att använda mikroflödessystem enheter. Användningen av mikrofluidik för axotomy har i stor utsträckning beskrivits 17-22. Vi finner att med konsekvent använda, är lasern fungerar bäst när Kumarin 440 i färgen cellen byts en gång varje vecka enligt det förfarande som beskrivs i MicroPoint manualen. Vid behov kan dämpningen reglaget användas för att öka makten, men detta kan vara ett tecken på gammal färg eller laser förskjutning. Dessutom har färgen cellen en begränsad livslängd och kommer så småningom att behöva byggas om eller bytas ut (se Felsökning). Det kan vara svårt att manövrera målet neurite under hårkorset som markerar laser fokus, särskilt om djuret ofullständigt är förlamad. Vi finner att en manuell skede inte är optimalt för detta ändamål, men det är verkligen användbar. En joystick-styrd motoriserade stadiet är mer exakt, och vi anser att användning programvara som stöder bilden att dra med musen för att flytta motoriserade scenen är bäst. Nikon Elements ger denna funktion och beskrivs i detta protokoll, men den fria Micromanager paketet, liksom andra bildhanteringsprogram, kan ha liknande funktionalitet. Ett annat sätt av fina inriktning är att flytta lasern fokus, snarare än djuret. En galvanometer balk-styrmekanism finns som ett tillägg till MicroPoint laser, om detta tillvägagångssätt är att föredra. Förutom sin ansökan till att studera neuronal regeneration, kan lasern användas för att avlägsna andra celltyper, såsom hud, muskler eller specialiserade celler, eller för att störa specifika neuronala synapser 23-27. Dessutom kan vägar som reglerar degeneration av nervceller som medföljer skada eller sjukdom undersökas med detta system. Som sådan kommer att använda pulsad laser fortsätta att belysa både genetiska faktorer och cellbiologiska förändringar som underlättar neuronal regeneration och andra relevanta processer. Felsökning: Som beskrivs här är några vanliga problem och tillhörande lösningar. <ol type="a"><li> Lasern är inte skära ordentligt. Detta är sannolikt eftersom antingen lasern är ur fokus (se avsnitt 2), eller färgen på färgen cellen behöver bytas ut (se MicroPoint manualen). Alternativt kan färgen cellen behöver bytas ut eller byggas om. </li><li> Maskarna rör sig om agaros pad. Detta är vanligtvis ett tecken på att agarosen pad är för fuktigt. Vi finner att kuddar måste lämnas i ungefär 30 sekunder innan maskar som ställs på dem att kringgå detta problem. Du kan också försöka använda mindre storlek (0,05 mikrometer) mikrokulor. </li><li> Återhämtningen av maskar är svårt och ineffektivt. Detta kan orsakas av felaktig täckglas borttagning eller genom en torr agaros pad. Om plattan är för torr, kan du märka att axoner utveckla en pärlstav utseende. I vissa fall beror det på att maskarna inte placerades på plattan snart nog efter att den gjordes. Alternativt kan ett gammalt lager av agaroslösningen har högre än 3% koncentration efter upprepad smältning. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> 0,05 ìm Polystyren Pärlor </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08.691 </td><td></td></tr><tr><td> 0,10 ìm Polystyren Pärlor </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00.876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosen GPG / LE </td><td> Amerikanska Bioanalytiska </td><td> 00.972 </td><td> Ultrarent </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml Polystyren rundbottnad Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352.057 </td><td> 17 x 100 mm stil, nonpyrogenic </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Plain precleaned objektglas </td><td> Erie Vetenskaplig Företag </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Täckglas </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm Nr 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Vetenskap Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34.155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm Style petriskål </td><td> BD Biosciences </td><td> 351.029 </td><td></td></tr><tr><td> Tejp tom 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Immersionsolja </td><td> Nikon </td><td></td><td> Typ A, ND = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 eller CZ1200 </td><td> C. elegans Genetiska Center </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> FÖRE Vetenskapliga </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Element Ar eller Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MicroPoint Ablation Laser System </td><td> Fotoniska Vetenskapliga </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sammansatta mikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Kamera </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modell C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC med Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Version 2002, Serie Pack 3 </td></tr><tr><td> Dubbla torr bad Incubator </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Analog kontroll </td></tr><tr><td> 4X Plan Fluor mål </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Plan Apo VC olja mål </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 pincett </td><td> Dumont </td><td> 11.251-35 </td><td> Dumoxel standard tips kan också använda # 7 </td></tr><tr><td> Analysera Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> Med NI-150 High Intensity Illuminator </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Nervceller kommunicerar med andra celler via axoner och dendriter, smal membran tillägg som innehåller före eller postsynaptiska inriktningar. Om en neuron är skadade av skada eller sjukdom, kan det återhämta sig. Cell-endogena och exogena faktorer påverkar möjligheten för en neuron för att förnya och återställa funktion. Nyligen, rundmasken C. elegans har trätt fram som en utmärkt modell organism för att identifiera gener och signalvägar som påverkar förnyelse av nervceller 1-6. Det huvudsakliga sättet att inleda neuronal regeneration i C. elegans är laser-medierad skär eller axotomy. Under axotomy är ett fluorescerande-märkt neuronala processen avhuggna med hög energi pulser. Inledningsvis neuronal regeneration i C. elegans undersöktes med hjälp av en förstärkt femtosecond laser 5. Dock har senare förnyelse studier visat att en konventionell pulsad laser kan användas för att noggrant skära nervceller in vivo och framkalla en liknande regenerativ svar 1,3,7. Vi presenterar ett protokoll för att utföra in vivo laser axotomy i masken med hjälp av en MicroPoint pulsad laser, ett nyckelfärdigt system som är lätt tillgängliga och som har använts i stor omfattning för riktade cell ablation. Vi beskriver rikta lasern, montering av maskar, kapning specifika nervceller, och bedöma efterföljande föryngring. Systemet ger möjlighet att skära ett stort antal nervceller i flera maskar under ett experiment. Således är laser axotomy som beskrivs häri ett effektivt system för att initiera och analysera processen för förnyelse.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Laser Axotomy in C. elegans at JoVE.com

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Ett protokoll för att skära nervceller i<em&gt; C. elegans</em&gt; Med en MicroPoint pulsad laser presenteras. Vi beskriver införandet av systemet, immobilisera maskar och skära märkta nervceller. Fördelar är en relativt låg kostnad systemet och möjligheten att avskilja neuronala processer eller ablate celler<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Automatiserad Kvantifiering av synaptisk Fluorescens i<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

C. elegans Tracking och Behavioral mätning

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

En molekylär Avläsning av långsiktigt Olfactory anpassning i<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal kalcium Imaging i C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Visualisering neuroblast cytokines Under<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Lasernanosurgery av Cerebellar Axoner<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In vivo avbildning av Dauer specifika Neuronal Remodeling i C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...