Name: seven steps to stellate cells
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seven Steps to Stellate Cells at JoVE.com

Detta arbete har finansierats av familjen Smith Award for Excellence inom biomedicinsk forskning och NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer och Melanie Flach stöds av PhD stipendier från Boehringer Ingelheim Foundation.

C57BL / 6 möss bör användas vid ~ 20 veckor eller äldre. Användningen av hanmöss som väger 25-30g rekommenderas. Avkastningen av stellate celler kan ökas genom att mata möss en A-vitamin-berikad diet för 2 månader före stellate cell isolering. Ungefär 2x10 5 nedsatt stellate celler kan renas från levern för en C57BL / 6 mus, medan avkastningen av stellate celler från BALB / c möss är betydligt högre. Följande protokoll justeras till 5 möss. Djuromsorg och experiment har utförts i enlighe...

<ol>
	<li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+protean,+multifunctional,+and+enigmatic+cells+of+the+liver.">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li><li>Geerts, A. H. i. s. t. o. r. y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heterogeneity,+developmental+biology,+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells.">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li><li>Gressner, A. M. &. a. m. p. ;. a. m. p., Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets.">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li><li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells:+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension.">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li><li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses.">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li><li>Minicis, S. D. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo.">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li><li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers:+distinct+roles+of+(myo-)fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair.">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li></ol>

Nedsatt stellate celler reglerar grundläggande fysiologiska och patofysiologiska processer i levern. Dessutom stellate celler har antigenpresenterande egenskaper gör dem en viktig del av nedsatt immunsvar. Även nedsatt stellate cellerna utgör 10-15% av det totala antalet celler i levern, är isolering av dessa celler utmanande på grund av sin lokalisering i perisinusoidal loppet av spridning och annan. Här presenterar vi en enkel metod att isolera celler nedsatt stellate från mus leve...

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn av Reagens </th><th> Företag </th><th> Katalognr </th></tr><tr><td> 70μm Cell Sil </td><td> BD </td><td> 352.350 </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Kollagenas P </td><td> Roche </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11.960 </td></tr><tr><td> DNas jag </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> Fetalt bovinserum </td><td> Gibco </td><td> 16 tusen </td></tr><tr><td> Glukos </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Gradient Centrifugering Rör </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 163.160 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco </td><td> 15.630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25.030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63.068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71.643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71.507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71.628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15.140 </td></tr><tr><td> Slangpumpar </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> Fenolrött </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase E </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> Silikonslang </td><td> Masterflex </td><td> HV-96.440-14 </td></tr><tr><td> Natrium Pyruvat </td><td> Gibco </td><td> 11.360 </td></tr><tr><td> Vävnadskultur kolv (25 cm 2) </td><td> BD </td><td> 353.108 </td></tr><tr><td> Bevingat infusionsset </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

seven steps to stellate cells

Nedsatt stellate celler lever hemmahörande celler av star-liknande morfologi och ligger inom loppet av spridning och annan mellan lever sinusformad endotelceller och hepatocyter 1,2. Stellate celler från benmärg prekursorer och lagra upp till 80% av kroppens totala vitamin A 1, 2. Vid aktivering stellate cellerna differentieras till myofibroblaster att producera extracellulär matrix, vilket bidrar till leverfibros 3. Baserat på deras förmåga att ingå avtal, kan myofibroblastic stellate celler reglerar kärltonus i samband med portal hypertension 4. Nyligen visade vi att levern stellate celler potenta antigenpresenterande celler och kan aktivera NKT celler och konventionella T-lymfocyter 5. Här presenterar vi en metod för effektiv framställning av celler i levern stellate från mus lever. På grund av sin perisinusoidal lokalisering, är isolering av celler nedsatt stellate en process i flera steg. För att göra stellate celler tillgänglig för isolering från det utrymme för spridning och annan, är musen lever perfusion in situ med matsmältningsenzymer Pronase E och kollagenas P. Efter perfusion är levervävnaden genomgå ytterligare enzymatisk behandling med Pronase E och kollagenas P vitro. Därefter tar metoden nytta av den massiva mängd av vitamin A-lagring lipiddropparna i celler nedsatt stellate. Denna funktion gör att separation av stellate celler från andra typer levern celler genom centrifugering på en 8% Nycodenz lutning. Protokollet som beskrivs här ger en mycket ren och homogen population av stellate celler. Renhet av preparat kan bedömas genom färgning för markören molekylen gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) före analys av fluorescensmikroskopi eller flödescytometri. Vidare avslöjar ljusmikroskopi den unika utseende stjärnformade celler i levern stellate som hyser höga halter av fett droppar. Sammantaget presenterar vi ett detaljerat protokoll för effektiv isolering av celler lever stellatum, inklusive representativa bilder av deras morfologiska utseende och GFAP uttryck som hjälper till att definiera stellate cellen enhet.

Watch this Scientific Journal Video about Seven Steps to Stellate Cells at JoVE.com

Seven Steps to Stellate Cells

Här beskriver vi en metod för isolering av celler i levern stellate från mus lever. För stellatum cell rening, är musen lever rötas<em&gt; På plats</em&gt; Och<em&gt; In vitro</em&gt; Genom pronase-kollagenas behandling före densitetsgradient centrifugering. Denna teknik ger mycket ren celler nedsatt stellate.

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Bedöma stomatal Svar på Live bakterieceller med hela blad Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Efter Cell-öde i<em&gt; E. E. coli</em&gt; Efter infektion av fag lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

En modifierad EPA Method 1623 som använder tangentiellt flöde Ihåliga fibrer Ultrafiltrering och Heat dissociation åtgärder för att upptäcka Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Och<em&gt; Giardia SPP.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nya verktyg för att expandera reglerande T-celler från HIV-1-infekterade individer

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenoviral Transduktion av naiva CD4 T-celler för att studera Treg Differentiering

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Utveckling av ett antigen-driven kolit modell för att studera Presentation av antigener genom antigenpresenterande celler till T-celler

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung skivor att visualisera Live Pulmonary dendritiska celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...