Name: a simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids at JoVE.com

Автор хотел бы поблагодарить д-ра Dongxuan Цзя для оказания технической помощи. Некоторые из изображений, входящих в этой статье, были в сотрудничестве с доктором Малкольмом С. Штейнберг, кафедра молекулярной биологии Принстонского университета. Автор также хотел бы поблагодарить Министерство обороны рака простаты Программа исследований (гранты PC-030 482 и PC-991 552) и NCI / NIH (грант R01CA118755) за их щедрую поддержку.

1. Подготовка суспензии отдельных клеток <ol><li> Приверженец клеточных культур следует выращивать до 90% слияния, после чего монослоев должны быть дважды промывали PBS. После слива, добавьте 2 мл (на 100 мм пластины) в размере 0,05% трипсина-1 мМ ЭДТА, и инкубировать при температуре 37 ° С до клетки ...

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices.">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signaling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li><li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-layer+surface+tensions+and+&amp;quot;tissue+affinities&amp;quot;+in+Rana+pipiens+gastrulae:+quantitative+measurements.">Germ-layer surface tensions and &amp;quot;tissue affinities&amp;quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li><li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle.">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing.">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li><li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wound+contraction:+collagen+organization,+fibroblasts,+and+myofibroblasts.">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li><li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li><li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures:+a+different+perspective+in+epithelial+biology.">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li><li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle.">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li><li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells.">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li><li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+structure,+nuclear+organization,+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast.">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li><li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma.">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li><li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li></ol>

Исследования показали, что культивирование клеток в трехмерном контексте (3D) производит различные клеточной морфологии и сигнализации по сравнению с жесткой двумерной (2D) системе культуры 9. Например, фибробластов населенных гели коллагена показывают, что фибробласты морфологи?...

<ul><li> автоматический счетчик клетки (BioRad TC10) </li><li> встряхивания водяной бане с CO 2 фронтона крышкой Модель 3540 (Лаборатория-лайн) </li></ul>

a simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids

Исследование межклеточных сплоченности и клеточного субстрата адгезии исторически были выполнены на однослойной культуре приверженцем жестких носителях. Клетки в тканях, однако, как правило, заключенная в плотно упакованной массы тканей, при котором клетки создания интимной связи со многими почти соседями и компонентов внеклеточного матрикса. Соответственно, среда химические и физические силы испытывают клетки в 3D ткани принципиально иные, чем те испытывают клеток, выращенных в монослой культуры. Это было показано, что заметно влияние клеточной морфологии и сигнализации. Несколько методов было разработано для создания 3D-культур клеток, включая инкапсуляции клеток в коллаген гели 1 или в биоматериала лесов 2. Такие методы, в то время как полезные, не повторять интимных прямой межклеточной адгезии архитектуры находится в нормальных тканях. Скорее, они больше приближены системы культуры, в которой отдельные клетки слабо диспергированы в 3D-сети из продуктов ECM. Здесь мы опишем простой метод, при котором клетки помещаются в висячей капли культуры и инкубировали в физиологических условиях, пока они не образуют истинные 3D сфероидов, в которой клетки находятся в непосредственном контакте друг с другом и с компонентов внеклеточного матрикса. Метод не требует специального оборудования и может быть адаптирован для включения добавления каких-либо биологического агента в очень малых количествах, которые могут представлять интерес для выяснения влияния на межклеточной или клеточной ECM взаимодействия. Метод может быть также использована для совместного культуры двух (или более) различных клеточных популяций, чтобы выяснить роль межклеточных или клеточно-ECM взаимодействий в определении пространственных отношений между ячейками. Cell-ячейки сплоченности и клеточной адгезии ECM являются краеугольным камнем исследования эмбрионального развития, опухоли стромальных клеток взаимодействия в злокачественные вторжения, заживление ран, а также для приложений к тканевой инженерии. Этот простой метод обеспечит средство получения ткани, как сотовые заполнители для измерения биомеханических свойств или молекулярные и биохимические анализы в физиологически соответствующие модели.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids at JoVE.com

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Мы опишем простой, быстрый способ получения 3D-ткани, как сфероиды и их потенциальное использование количественного различия в межклеточных взаимодействиях.

Простые висячей капли культуре клеток Протокол Генерация 3D сфероидов

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Подготовка 3D фибрина лесов для стволовых Приложения культуре клеток

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Гидрогель Строительные леса для суставной хондроцит культуры и хряща поколения

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Протокол для слежения в реальном времени 3D одной частицы

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Строительство многослойных мезенхимальных стволовых клеток листа с системой 3D динамичной культуры

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Человек 3D Экстраклеточная матрица-Адипоцит Культура Модель для изучения Матрица-Клеточная метаболический перекрестный разговор

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Крупномасштабное автоматизированное производство сфероидов стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для 3D-биопечати

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

Генерация многоклеточных клеточных микросред путем УФ-фотоструктурирования трехмерных субстратов клеточных культур

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Сфероиды печени человека из периферической крови для исследований заболеваний печени

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...