Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

نشكر المعهد الوطني للصحة (1R21CA138373 وانهض لمكافحة السرطان (SU2C) عن الدعم المالي لهذا العمل. HY تشعر بالامتنان للحصول على جائزة Elion 2009 من الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان ، وهي جائزة الباحث كيميل من مؤسسة سيدني كيميل ل أبحاث السرطان (SKF - 08 - 101) ، وكلية المؤسسة الوطنية للعلوم في وقت مبكر جائزة شهادة (NSF0954819).

1. الاستنساخ اعتبارات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ligated [أليغنوكليوتيد] أعد تجاريا يمثلون المصالح TMD محاط NheI والمواقع وتقييد BamHI 5&#39; - فسفرته في pTox7 (تعديلها في المختبر لدينا من قبل الإدراج من الزوج قاعدة واحدة مباشرة بعد تقييد موقع BamHI 14) (...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

في مقايسة ToxR مراسل الترانسكربتي هو وسيلة سهلة لتحديد تسلسل عبر الغشاء مع احتمال oligomerize. منذ التفاعلات التي تحدث داخل الغشاء الداخلي البكتيرية ، وهذا الاختبار تلتف حول القضايا المرتبطة بصحة نظم الدراسة في بيئات المحاكاة الأغشية. نظرا إلى أن الاستنساخ يمكن بسهولة من TM...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> BamHI تقييد انزيم </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> تم العثور على الانزيمات Invitrogen لتكون أكثر كفاءة من موردين بديلين </td></tr><tr><td> NheI تقييد انزيم </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> تم العثور على الانزيمات Invitrogen لتكون أكثر كفاءة من موردين بديلين </td></tr><tr><td> 15 مل من أنابيب الثقافة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-956 - 1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC وسائل الإعلام </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> تتكون وحدة التخزين المناسبة وتعقيمها قبل التعقيم. </td></tr><tr><td> LB وسائل الإعلام </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L7275 </td><td> تتكون وحدة التخزين المناسبة وتعقيمها قبل التعقيم. </td></tr><tr><td> الكلورامفينيكول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> CO 3 78 </td><td> محلول المخزون من 30 ملغ / مل في الإيثانول تخزينها في الفريزر </td></tr><tr><td> أرابينوز </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> محلول المخزون 2.5 ٪ (W / V) في المياه المخزنة في الثلاجة </td></tr><tr><td> غ 2 4 هبو </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> ناه 2 ص 4 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> بوكل </td><td> مالينكرودت كيماويات </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> dodecylsulfate الصوديوم (SDS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - Nitrophenyl β - D - galactopyranoside (ONPG) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z - العازلة </td><td></td><td></td><td> 16.1 ز نا 2 4 هبو 5.5g ناه 2 ص 4 0.75g بوكل 0.246g MgSO 4 ما يصل إلى 1 لتر ، ودرجة الحموضة 7.0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 مل β - المركابتويثانول ، 2 مل كلوروفورم ، وجعل ما يصل الى 20 مل مع Z - العازلة. دوامة الطرد المركزي : 1 ، 1 دقيقة دقيقة للفي 800 دورة في الدقيقة. جعل كل لوحة جديدة ل. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 ملغ SDS المذاب في 10 مل Z - العازلة </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 ملغ في 10 مل ONPG Z - العازلة. جعل كل لوحة جديدة ل </td></tr><tr><td> β - المركابتويثانول </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة MBP ريتوكسيماب (HRP مترافق) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> الحد الأدنى من وسائل الاعلام مع المالتوز </td><td></td><td></td><td> 1 × M9 الأملاح والمالتوز 0.4 ٪ ، 1 ملغ / مل الثيامين ، 2 مم MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96 - جيدا لوحة مسطحة القاع </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> لوحة قارئ </td><td> بيكمان كولتر </td><td> DTX880 الكاشف المتعدد </td><td></td></tr><tr><td> ماء الحمام </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> هز الحاضنة </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

رأي التبسيط من المجالات عبر الغشاء البروتين هو مجرد المراسي في طبقات ثنائية فسفوليبيد منذ زمن طويل ثبت بطلانها. في كثير من الحالات تطورت الأغشية التي تغطي البروتينات آليات متطورة للغاية للعمل. 1-3 وإحدى الطرق التي يمكن أن تعدل بروتينات غشاء هياكلها ووظائفها هي عن طريق الاتصال المباشر ومحددة من اللوالب مسعور ، وتشكيل oligomers عبر الغشاء منظم. 4،5 الأخيرة الكثير وقد تركز العمل على توزيع الأحماض الأمينية وجدت في بيئة تفضيلي غشاء مقارنة محلول مائي والقوات بين الجزيئات المختلفة التي تدفع الجمعيات البروتين. 6،7 ومع ذلك ، فإن الدراسات الاعتراف الجزيئية في المجال للبروتينات عبر الغشاء لا يزال متخلفا عن تلك التي للذوبان في الماء المناطق. لا تزال هناك عقبة رئيسية : على الرغم من خصوصية ملحوظة والتي تقارب oligomerization عبر الغشاء يمكن أن يحقق ، 8 القياس المباشر انتماءاتهم ليست هينة. يمكن أن تعوق تطبيق المنهجيات التقليدية لدراسة الغشاء لا يتجزأ من وظيفة البروتين اللاانحلال المتأصلة في متواليات تحت الفحص. يمكن رؤى البيوفيزيائية المكتسبة من دراسة المجالات التي تمثل الببتيدات الاصطناعية عبر الغشاء تقدم نظرة هيكلية مفيدة. ومع ذلك ، شكك في كثير من الأحيان أهميتها البيولوجية للmicellar المنظفات أو أنظمة الحويصلية المستخدمة في هذه الدراسات لتقليد الأغشية الخلوية ؛ لا الببتيدات اعتماد هيكل الأم تشبه في ظل هذه الظروف وسلوكهم الوظيفي لا تعكس حقا طريقة العمل داخل غشاء الأم ؟ تطوير مختبر Langosch لدراسة التفاعلات بين متواليات عبر الغشاء في طبقات ثنائية فسفوليبيد الطبيعية ، والمقايسات ToxR مراسل النسخي. يعبر 9 المجال عبر الغشاء من الفائدة وهو بروتين خيالية مع بروتين ملزمة المالتوز عن الموقع إلى الجبلة المحيطية وToxR تقديم تقرير مستوى oligomerization (الشكل 1). في العقد الماضي ، العديد من المجموعات الأخرى (مثل Engelman ، DeGrado ، شاي) وكذلك تحسين تطبيق هذا الاختبار مراسل ToxR. 10-13 والمقايسات ToxR مختلف اصبحت معيار الذهب لاختبار البروتين البروتين التفاعلات في أغشية الخلايا. نظهر هنا عملية نموذجية تجريبية أجريت في المختبر لدينا في المقام الأول الذي يلي البروتوكولات التي وضعتها Langosch. هذا الأسلوب ينطبق عموما مفيدة لتحليل الذات عبر الغشاء الجمعيات في مجال E. القولونية ، حيث يتم استخدام β - غالاكتوزيداز الإنتاج لتقييم النزوع oligomerization انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى. TMD المحرض على dimerization ، ToxR بربط المروج CTX مما يصل تنظيم الجينات LacZ لغالاكتوزيداز - β. يتم الحصول على قراءات اللونية التي ONPG إضافة إلى خلايا lyzed. حلمهي تشطر من ONPG بواسطة β - غالاكتوزيداز النتائج في إنتاج أنواع ضوء تمتص س nitrophenolate (ONP) (الشكل 2).

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

يوصف إجراء فعال لتقييم النزوع oligomerization من المجالات عبر الغشاء المفرد مرور (TMDS). يتم التعبير عن البروتينات خيالية تتكون من انظمة الدفاع الصاروخى التكتيكى لتنصهر في ToxR مراسل سلالة E. القولونية. TMD بفعل أسباب oligomerization dimerization من ToxR ، وتفعيل النسخ وإنتاج البروتين المراسل ، - غالاكتوزيداز.

الميل عبر الغشاء Oligomerization المجال يحدده الفحص ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

توصيف G مستقبلات البروتين يقترن بها الكالسيوم تعبئة الفحص القائم على الإسفار

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

إعادة تشكيل البروتين عبر الغشاء، وايون القناة بوابات الجهد، KvAP، إلى العملاق Unilamellar الحويصلات للفحص المجهري وتصحيح الدراسات المشبك

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

رسم الخرائط البصرية البينية العضلية شبكية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; وإمكانية الغشاء في قلب الأرنب Langendorff perfused-

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

النهج الوراثية والبيوكيميائية ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; تقييم Oligomerization البروتين: دراسة حالة Ryanodine مستقبلات

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

دراسة اندوبلازمية شبكية والميتوكوندريا التفاعلات التي كتبها<em&gt; في الموقع</em&gt; القرب من ربط الفحص في خلايا ثابتة

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...