Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

We bedanken de National Institutes of Health (1R21CA138373 en Stand Up naar Kanker (SU2C) voor financiële ondersteuning van dit werk. HY is dankbaar voor de 2009 Elion Award van de American Association of Cancer Research, een Kimmel Scholar Award van het Sidney Kimmel Stichting voor Cancer Research (SKF-08-101), en de National Science Foundation Faculteit Early Career Award (NSF0954819).

1. Klonen Overwegingen <ol><li> Commercieel bereide oligonucleotiden die de TMD van belang geflankeerd door Nhel en BamHI restrictie sites en 5&#39;-gefosforyleerd kunnen worden geligeerd in pTox7 (gewijzigd in ons laboratorium door het inbrengen van een basepaar direct na de BamHI restrictieplaats 14) (Figuur 3) sequentieel verteerd met BamHI en Nhel. Een voorbeeld oligonucleotide wordt hieronder weergegeven: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &#39; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5&#39; </li></ol><p class="jo...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

De ToxR transcriptionele reporter assay is een gemakkelijke manier om transmembraan sequenties te identificeren met de potentie om oligomerize. Omdat de interacties die zich in de bacteriële binnenste membraan, deze test omzeilt de kwesties in verband met de geldigheid van het bestuderen van systemen in membraan-mimetische omgevingen. Gezien het feit dat het klonen van meerdere TMDs in een plasmide gemakkelijk kan parallel worden uitgevoerd en de gehele test kan worden uitgevoerd in 96-well plaat formaat, kan deze test...

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Commentaar (optioneel) </th></tr><tr><td> BamHI restrictie-enzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzymen bleken efficiënter dan andere leveranciers </td></tr><tr><td> Nhel restrictie-enzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzymen bleken efficiënter dan andere leveranciers </td></tr><tr><td> 15 ml kweekbuizen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC media </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Aangevuld tot het juiste volume en gesteriliseerd in de autoclaaf. </td></tr><tr><td> LB media </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Aangevuld tot het juiste volume en gesteriliseerd in de autoclaaf. </td></tr><tr><td> Chlooramfenicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Stock oplossing van 30 mg / ml in ethanol worden opgeslagen in de vriezer </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Stock-oplossing van 2,5% (w / v) in water opgeslagen in de vriezer </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Chemicals </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0.7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium dodecylsulfaat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrofenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Make up tot 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-mercapto-ethanol, 2 ml chloroform, vul aan tot 20 ml met Z-buffer. Vortex gedurende 1 minuut, centrifuge voor een min bij 800 rpm. Maak vers voor elke plaat. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS opgelost in 10 ml Z-buffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG in 10 ml Z-buffer. Maak vers voor elke plaat </td></tr><tr><td> β-mercapto-ethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonaal antilichaam (HRP geconjugeerd) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Minimale media met maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 zouten, 0,4% maltose, 1 mg / ml thiamine, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-well vlakke bodemplaat </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-reader </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode Detector </td><td></td></tr><tr><td> Waterbad </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Shaking incubator </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

De ongenuanceerde weergave van eiwitten transmembraan-domeinen als slechts ankers in fosfolipide is allang weerlegd. In veel gevallen membraan-spanning eiwitten geëvolueerd zeer geavanceerde werkingsmechanismen. 1-3 Een van de manieren waarop membraaneiwitten kunnen moduleren hun structuren en functies is door direct contact en specifiek van hydrofobe helices, de vorming van gestructureerde transmembraan oligomeren. 4,5 veel recente werk is gericht op de verdeling van aminozuren bij voorkeur gevonden in het membraan milieu in vergelijking met waterige oplossing en de verschillende intermoleculaire krachten die rijden eiwit vereniging. niettemin 6,7, studies van moleculaire herkenning bij het ​​transmembraan domein van eiwitten nog steeds achterblijft bij die van de water-oplosbare regio&#39;s. Een belangrijk struikelblok blijft: ondanks de opmerkelijke specificiteit en affiniteit die transmembraan oligomerisatie kan bereiken, 8 directe meting van hun vereniging is een uitdaging. Traditionele methoden toegepast op de studie van integrale membraaneiwit functie kan worden bemoeilijkt door de inherente onoplosbaarheid van de sequenties in onderzoek. Biofysische inzichten uit het bestuderen van synthetische peptiden die transmembraan-domeinen kan nuttige structureel inzicht. Echter, de biologische relevantie van het detergens micellaire of liposoom systemen die worden gebruikt in deze studies aan de celmembranen na te bootsen vaak in twijfel getrokken; peptiden hebben een native-achtige structuur vast te stellen onder deze omstandigheden en die hun functionele gedrag een reële afspiegeling van de wijze van actie binnen een native membraan ? Om de interacties van transmembraan-sequenties in natuurlijke fosfolipide studie, de Langosch lab ontwikkelde ToxR transcriptionele reporter assays. 9 De transmembraan domein van belang is uitgedrukt als een chimeer eiwit met maltose-bindend eiwit voor de locatie aan de periplasma en ToxR om een verslag op te stellen van het niveau van de oligomerisatie (figuur 1). In het laatste decennium, verschillende andere groepen (bijvoorbeeld Engelman, DeGrado, Shai) verder geoptimaliseerd en paste deze ToxR reporter assay. 10-13 De verschillende ToxR assays zijn uitgegroeid tot een gouden standaard voor eiwit-eiwit interacties test in celmembranen. We laten zien hierin een typisch experimentele operatie uitgevoerd in ons laboratorium, dat in de eerste plaats volgt protocollen ontwikkeld door Langosch. Deze algemeen toepasbare methode is bruikbaar voor de analyse van transmembraandomein zelfassociatie in E. coli, waar de β-galactosidase productie wordt gebruikt om de TMD oligomerisatie neiging te beoordelen. Bij TMD-geïnduceerde dimerisatie, ToxR bindt zich aan de ctx promotor veroorzaakt up-regulatie van het lacZ-gen voor β-galactosidase. Een colorimetrische uitlezing wordt verkregen door toevoeging van ONPG aan lyzed cellen. Hydrolytische splitsing van ONPG door β-galactosidase resulteert in de productie van het licht absorberende soort o-nitrofenolaat (ONP) (figuur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Een efficiënte procedure om de oligomerisatie neiging van single-pass transmembraan-domeinen (TMDs) te beoordelen wordt beschreven. Chimère eiwitten bestaande uit de TMD gefuseerd aan ToxR worden uitgedrukt in een E. coli stam verslaggever. TMD-geïnduceerde oligomerisatie oorzaken dimerisatie van ToxR, activatie van transcriptie en de productie van de reporter eiwit-galactosidase.

Transmembraan domein oligomerisatie Propensity bepaald door ToxR Assay

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressie en zuivering van de Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator Eiwit in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Zuivering van het Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator eiwit dat tot expressie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karakterisering van G-eiwit gekoppelde receptoren met een op fluorescentie gebaseerde calcium mobilisatie Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetische en biochemische benaderingen voor<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluatie van Protein Oligomerisatie: De ryanodinereceptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...