Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
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Nous remercions les National Institutes of Health (1R21CA138373 et Stand Up to Cancer (SU2C) pour les supports financiers de ce travail. HY est reconnaissante pour le Prix 2009 Elion de l&#39;American Association of Cancer Research, une Scholar Award de la Fondation Kimmel Sidney Kimmel pour Recherche sur le Cancer (SKF-08-101), et la National Science Foundation Faculté de carrière Prix précoce (NSF0954819).

1. Considérations clonage <ol><li> Oligonucléotides préparés commercialement représentant le TMD d&#39;intérêt flanqué Nhel et des sites de restriction BamHI et 5&#39;-phosphorylés peuvent être ligaturés dans pTox7 (modifié dans notre laboratoire par insertion d&#39;une paire de base directement après le site de restriction BamHI 14) (figure 3) digéré séquentiellement avec BamHI et Nhel. Un oligonucléotide exemple est illustré ci-dessous: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &#39; 3 &#39...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

Le dosage de ToxR journaliste de la transcription est un moyen aisé d&#39;identifier les séquences transmembranaires ayant le potentiel de oligomériser. Depuis les interactions se produisent dans la membrane bactérienne interne, ce test contourne les problèmes liés à la validité des systèmes d&#39;étudier dans la membrane-mimétiques environnements. Étant donné que le clonage des PTM multiples en un seul plasmide peut facilement être fait en parallèle et le dosage complet peut être réalisée en format 96...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Enzyme de restriction BamHI </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzymes ont été jugées plus efficaces que les fournisseurs alternatifs </td></tr><tr><td> Enzyme de restriction Nhel </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzymes ont été jugées plus efficaces que les fournisseurs alternatifs </td></tr><tr><td> 15 tubes de culture ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC des médias </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Constitué au volume approprié et stérilisé par autoclavage. </td></tr><tr><td> Milieu LB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Constitué au volume approprié et stérilisé par autoclavage. </td></tr><tr><td> Le chloramphénicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Solution mère de 30 mg / ml dans l&#39;éthanol stocké dans un congélateur </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Solution mère de 2,5% (p / v) dans de l&#39;eau stockée dans un congélateur </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Produits chimiques Mallinckrodt </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Dodécylsulfate de sodium (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrophényl β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g de Na 2 HPO 4 5.5g de NaH 2 PO 4 0,75 g de KCl 0.246g MgSO 4 Compléter à 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-mercaptoéthanol, 2 ml de chloroforme, faire jusqu&#39;à 20 mL avec du Z-buffer. Vortex pendant 1 min, centrifuger 1 min à 800 tpm. Faire frais pour chaque plaque. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg de SDS dissout dans 10 ml de Z-buffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG dans 10 ml de Z-buffer. Faire frais pour chaque plaque </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP anticorps monoclonal (HRP conjugué) </td><td> ONE </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Milieu minimal avec le maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x sels M9, le maltose de 0,4%, à 1 mg / ml de thiamine, de 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à fond plat </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-lecteur </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 détecteur multimode </td><td></td></tr><tr><td> Bain-marie </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur agitateur </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

La conception simpliste des domaines transmembranaires des protéines comme de simples points d&#39;ancrage dans les bicouches phospholipidiques a depuis longtemps été réfuté. Dans de nombreux cas transmembranaire des protéines ont développé des mécanismes sophistiqués de l&#39;action. 1-3 Une façon dont les protéines membranaires peuvent moduler leurs structures et leurs fonctions se fait par contact direct et spécifique des hélices hydrophobes, formant des oligomères transmembranaire structuré. 4,5 récente grande travaux ont porté sur la répartition des acides aminés de préférence dans l&#39;environnement de membrane en comparaison à la solution aqueuse et les forces intermoléculaires différentes que l&#39;association de protéines disque 6,7. Néanmoins, les études de reconnaissance moléculaire à domaine transmembranaire des protéines est toujours en retard ceux de solubles dans l&#39;eau des régions. Un obstacle majeur demeure: malgré la spécificité remarquable et d&#39;affinité qui oligomérisation transmembranaire peut atteindre, 8 mesure directe de leur association est un défi. Méthodologies traditionnelles appliquées à l&#39;étude de la fonction des protéines membranaires intégrale peut être entravée par l&#39;insolubilité des séquences inhérentes à l&#39;étude. Aperçus tirés de l&#39;étude biophysique peptides synthétiques représentant domaines transmembranaires peuvent fournir un aperçu utile de structure. Toutefois, la pertinence biologique de la micellaire détergent ou systèmes liposomes utilisés dans ces études pour imiter les membranes cellulaires est souvent contestée, ne peptides adoptent une structure native-like dans ces conditions et leur comportement ne reflètent véritablement fonctionnelle du mode d&#39;action au sein d&#39;une membrane native ? Afin d&#39;étudier les interactions des séquences transmembranaires dans les bicouches de phospholipides naturels, le laboratoire Langosch au point des dosages ToxR journaliste de la transcription. 9 Le domaine transmembranaire d&#39;intérêt est exprimé comme une protéine chimérique avec protéine de liaison du maltose pour la localisation dans le périplasme et ToxR de fournir un rapport du niveau d&#39;oligomérisation (figure 1). Dans la dernière décennie, plusieurs autres groupes (par exemple Engelman, DeGrado, Shai) encore optimisé et appliqué ce test journaliste ToxR. 10-13 Les dosages différents ToxR sont devenus un standard en or pour tester les interactions entre protéines dans les membranes cellulaires. Nous présentes démontrent une opération typique expérimentales menées dans notre laboratoire que suit principalement les protocoles développés par Langosch. Cette méthode est généralement applicable utile pour l&#39;analyse de domaine transmembranaire auto-association dans E. coli, où β-galactosidase de production est utilisée pour évaluer la propension oligomérisation TMD. Sur TMD induite dimérisation, ToxR se lie au promoteur ctx provoquant une régulation positive du gène LacZ par β-galactosidase. Une lecture colorimétrique est obtenue par addition d&#39;ONPG à cellules lysées. Clivage hydrolytique d&#39;ONPG par la β-galactosidase résultats dans la production de l&#39;espèce absorbant la lumière o-nitrophénolate (ONP) (figure 2).

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Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Une procédure efficace pour évaluer la propension d&#39;oligomérisation des domaines transmembranaires un seul passage (TMDS) est décrite. Des protéines chimères comprenant le TMD fusionnée à ToxR sont exprimés dans une souche E. coli journaliste. TMD induite oligomérisation provoque la dimérisation du ToxR, activation de la transcription et la production de la protéine rapporteur,-galactosidase.

Propension oligomérisation domaine transmembranaire déterminée par dosage ToxR

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