Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
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Wir danken den National Institutes of Health (1R21CA138373 und Stand Up to Cancer (SU2C) für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit. HY ist dankbar für das Geschäftsjahr 2009 Elion Award von der American Association of Cancer Research, ein Kimmel Scholar Award der Sidney Kimmel Stiftung für Cancer Research (SKF-08 bis 101) und der National Science Foundation Fakultät Early Career Award (NSF0954819).

1. Cloning Überlegungen <ol><li> Kommerziell hergestellte Oligonukleotide, die die TMD von Interesse durch NheI und BamHI Restriktionsstellen und 5&#39;-phosphorylierten flankiert können in pTox7 (modified in unserem Labor durch Insertion von einem Basenpaar direkt nach dem BamHI 14) (Abbildung 3) verdaut nacheinander ligiert werden mit BamHI und NheI. Ein Beispiel Oligonukleotid ist unten dargestellt: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &quot; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5 &quot; </li></ol><p class="jove_...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

Die ToxR transkriptionelle Reporter-Assay ist eine einfache Möglichkeit, transmembrane Sequenzen mit dem Potenzial, oligomerisieren identifizieren. Da die Wechselwirkungen innerhalb der bakteriellen inneren Membran stattfindet, umgeht diesen Test die Probleme mit der Gültigkeit der Untersuchung von Systemen in Membran-Mimetikum-Umgebungen. Da das Klonen von mehreren TMDs in einem einzigen Plasmid leicht können parallel ausgeführt werden und der gesamte Test kann in 96-Well-Platte-Format durchgeführt werden, kann di...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> BamHI Restriktionsenzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten </td></tr><tr><td> NheI Restriktionsenzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten </td></tr><tr><td> 15 mL Kulturröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC-Medium </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. </td></tr><tr><td> LB-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Stammlösung von 30 mg / mL in Ethanol in Gefrierschrank gelagert </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Stammlösung von 2,5% (w / v) in Wasser im Gefrierschrank gelagert </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Chemicals </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranosid (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-Puffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Machen Sie bis zu 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 mL β-Mercaptoethanol, 2 mL Chloroform, machen bis zu 20 ml mit Z-Buffer. Vortex für 1 min, Zentrifuge für 1 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Machen Sie für jede Platte frisch. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS in 10 mL Z-Puffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG in 10 mL Z-Buffer. Machen Sie für jede Platte frischer </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonalen Antikörper (HRP-konjugiert) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Minimal-Medien mit Maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x M9-Salze, 0,4% Maltose, 1 mg / mL Thiamin, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-well Flachboden Platte </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-Reader </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode-Detektor </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Schüttelinkubator </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

Die vereinfachte Sicht von Protein Transmembrandomänen lediglich als Anker in Phospholipid-Doppelschichten ist längst widerlegt. In vielen Fällen membrandurchspannende Proteine ​​hochentwickelten Wirkmechanismen entwickelt. 1-3 Ein Weg in die Membranproteine ​​modulieren ihre Strukturen und Funktionen können durch direkten und konkreten Kontakt der hydrophoben Helices bilden strukturierte transmembrane Oligomere. 4,5 Großteil der jüngsten Arbeit über die Verteilung der Aminosäuren bevorzugt in der Membran-Umgebung im Vergleich zu wässrigen Lösung und die verschiedenen intermolekularen Kräfte, die Fahrt Protein-Assoziation. 6,7 Trotzdem Studien der molekularen Erkennung an der Transmembrandomäne von Proteinen immer noch hinter denen der Schwerpunkt gefunden wasserlöslichen Regionen. Eine große Hürde bleibt: Trotz der bemerkenswerten Spezifität und Affinität, die transmembrane Oligomerisierung erreichen können, 8 direkte Messung ihrer Vereinigung ist eine Herausforderung. Traditionelle Methoden angewendet, um das Studium integrale Membranprotein-Funktion kann durch die inhärenten Unlöslichkeit der Sequenzen unter Prüfung behindert werden. Biophysikalische Erkenntnisse aus dem Studium synthetischer Peptide, die Transmembrandomänen gewonnen werden können nützliche strukturelle Einsicht. Allerdings ist die biologische Relevanz des Waschmittels mizellaren oder Liposomen-Systeme in diesen Studien verwendet werden, um Zellmembranen imitieren oft in Frage gestellt; tun Peptide Annahme eines nativen Struktur unter diesen Bedingungen und hat ihre funktionale Verhalten wirklich die Wirkungsweise in einer nativen Membran ? Um die Wechselwirkungen von Transmembran-Sequenzen in natürlichen Phospholipid-Doppelschichten Studie entwickelten die Langosch Labor ToxR transkriptionelle Reporter-Assays. 9 Die Transmembrandomäne von Interesse, wie eines chimären Proteins mit Maltose-Bindungsprotein für die Lage auf dem Periplasma und ToxR ausgedrückt wird, um einen Bericht zu der Grad der Oligomerisierung (Abbildung 1). In den letzten zehn Jahren mehrere andere Gruppen (zB Engelman, DeGrado, Shai) weiter optimiert und wandte diese ToxR Reporter-Assay. 10-13 Die verschiedenen ToxR Assays haben sich zu einem Goldstandard, um Protein-Protein-Interaktionen in Zellmembranen zu testen. Wir hier zeigen einen typischen experimentellen Betrieb in unserem Labor, die vor allem folgende Protokolle, die von Langosch entwickelt durchgeführt. Diese allgemein anwendbare Methode für die Analyse der Transmembrandomäne Selbstassoziation in E. sinnvoll coli, wo β-Galaktosidase Produktion verwendet werden, um die TMD Oligomerisierung Neigung zu beurteilen ist. Bei TMD-induzierte Dimerisierung bindet ToxR die ctx-Promotor verursacht up-Regulierung des LacZ Gen für β-Galactosidase. Eine kolorimetrische Ablesung wird durch Zugabe von ONPG zu lysierten Zellen erhalten. Hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP) (Abbildung 2).

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Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.

Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Forschung

Biologie

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Rekonstitution der ein Transmembranprotein, das spannungsgesteuerten Ionenkanal, KvAP, in Riesen unilamellare Vesikel für Mikroskopie und Patch-Clamp-Studien

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

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Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

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Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...