Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
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我々は、国立衛生研究所を（1R21CA138373感謝し、この作品の金融支援のためのがん（SU2C）にスタンドアップ。HYのためのシドニーキンメル財団からのがん研究、キンメルScholarの賞の協会から2009年エリオン賞に感謝です。がん研究（SKF - 08 - 101）、および国立科学財団の学部初期のキャリア賞（NSF0954819）。

1。クローニングの考慮事項<ol><li> NheIとBamHIの制限部位と5&#39; -リン酸化によって挟ま関心のTMDを表す商業的に作製したオリゴヌクレオチドを順次消化pTox7（直接BamHI制限部位14日以降1塩基対の挿入によって私たちの研究室で修正された）（図3）に連結することができるBamHIおよびNheIで。例のオリゴヌクレオチドを​​以下に示します。 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3&quot; 3&#39;gTMDSEQUENC...

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	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

ToxR転写レポーターアッセイでは、オリゴマー化する可能性と膜貫通配列を同定するために手軽な方法です。相互作用が細菌の内膜内に発生しているので、このアッセイは、細胞膜模倣環境でシステムを研究の妥当性に関連する問題を回避することができます。単一のプラスミドに複数のTMDSのクローニングを容易に並列に行うことができ、全体のアッセイは96ウェルプレートフォーマットで?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> BamHI制限酵素</td><td>インビトロジェン</td><td> 15201023 </td><td>インビトロジェンの酵素は、代替のサプライヤーよりも効率的であることがわかった</td></tr><tr><td> NheI制限酵素</td><td>インビトロジェン</td><td> 15444011 </td><td>インビトロジェンの酵素は、代替のサプライヤーよりも効率的であることがわかった</td></tr><tr><td> 15 mLの培養管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 14から956 - 1J </td><td></td></tr><tr><td> SOCメディア</td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td>適切なボリュームに構成し、オートクレーブにより滅菌。 </td></tr><tr><td> LB培地</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L7275 </td><td>適切なボリュームに構成し、オートクレーブにより滅菌。 </td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> CO 3位 78 </td><td>冷凍庫に保存されているエタノール30 mg / mLの原液</td></tr><tr><td>アラビノース</td><td>フルカ</td><td> 10839 </td><td>水中の2.5％ストック溶液（w / v）を冷凍庫に保存され</td></tr><tr><td>のNa 2 HPO 4 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td>のNaH 2 PO 4 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> Mallinckrodtケミカルズ</td><td> 6858〜06 </td><td></td></tr><tr><td>のMgSO 4 · 7H 2 O </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - ニトロフェニルβ- D -ガラクトピラノシド（ONPG） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z -バッファ</td><td></td><td></td><td> 16.1グラムのNa 2 HPO 4 5.5グラムのNaH 2 PO 4 0.75グラムのKCl 0.246グラムのMgSO 4 1リットル、pH7.0にメイクアップ</td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200mLのβ-メルカプトエタノール、2 mLのクロロホルム、Z -バッファ、20 mLに構成しています。 1分間、800 rpmで1分間遠心するための渦。各プレートのための新鮮ください。 </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 10mLのZ -バッファに溶解した160 mgのSDS </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 10mLのZ -バッファの40 mgをONPG。各プレートのための新鮮な確認</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>カルビオケム</td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td>抗MBP抗体（HRP標識） </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td>マルトースと最少培地</td><td></td><td></td><td> 1 × M9塩、0.4％マルトース、1 mg / mLのチアミン、2mMのMgSO 4を </td></tr><tr><td> 96ウェル平底プレート</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>ベックマンコールター</td><td> DTX880マルチモード検出器</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td>振とう培養器</td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

リン脂質二重層で単にアンカーとしてのタンパク質の膜貫通ドメインの極端に簡略化ビューには、誤りであるので、長く持っています。多くの場合、膜貫通タンパク質は、アクションの非常に高度なメカニズムを進化させてきた。膜タンパク質はその構造と機能を調節することができる1〜3つの方法は、構造化された膜貫通のオリゴマーを形成する、疎水性ヘリックスの直接および特定の連絡先があります。4,5多くの最近の作業は6,7は 、それにもかかわらず。優先的に水溶液とドライブの蛋白質の関連付け、異なる分子間力と比較して膜の環境で見つかったアミノ酸の分布に焦点を当てているタンパク質の膜貫通ドメインにおける分子認識の研 ​​究は、まだのものに遅れている水溶性の領域。主要なハードルが残っている：貫通オリゴマー化が達成できる驚くべき特異性と親和性にもかかわらず、それらの関連の8の直接測定が困難です。内在性膜蛋白質機能の研究に適用される伝統的な方法論が検討中のシーケンスの固有の不溶性によって妨げられることができる。膜貫通ドメインを表す合成ペプチドを研究から得られた生物物理学的な洞察は、有用な構造的洞察を提供することができます。しかし、細胞膜を模倣するためにこれらの研究で使用される洗剤ミセルまたはリポソーム系の生物学的関連性はしばしば疑問視され、ペプチドは、これらの条件の下で天然様の構造を採用していないと各機能の動作は、真のネイティブ膜内で作用機序を反映していない？天然のリン脂質二重層の膜貫通配列の相互作用を研究するためには、LangoschラボはToxR転写レポーターアッセイを開発した。関心の9膜貫通ドメインがペリプラズムとToxRの位置については、マルトース結合タンパク質とのキメラタンパク質として発現されるレポートを提供するオリゴマー化のレベル（図1）の。 過去10年間で、いくつかの他のグループ（例：エンゲルマン、DeGrado、シャイ）さらにこのToxRのレポーターアッセイを最適化し適用した。10-13、様々なToxRアッセイは、細胞膜のタンパク質間相互作用をテストするためのゴールドスタンダードとなっています。我々はここに主にLangoschによって開発されたプロトコルを、次の我々の研究室で行われた代表的な実験操作を示す。この一般的に適用できる方法では、E.の膜貫通ドメインの自己会合の解析に有用です。 β-ガラクトシダーゼの生産はTMDオリゴマー化の傾向を評価するために使用される大腸菌 、。 TMD誘発性二量体化すると、ToxRはβ-ガラクトシダーゼのLacZ遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすCTXのプロモーターに結合する。比色読み出しはlyzed細胞へのONPGを添加することによって得られる。光吸収の種O - nitrophenolate（ONP）（図2）の産生におけるβ-ガラクトシダーゼの結果によるONPGの加水分解。

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Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

一回膜貫通ドメイン（TMDS）のオリゴマー化の傾向を評価するための効率的な手順が説明されています。 ToxRに融合されたTMDからなるキメラタンパク質は、大腸菌のレポーター株に発現されています。 TMD誘発性オリゴマーはToxR、転写およびレポータータンパク質の生産、-ガラクトシダーゼの活性化の二量体化を引き起こす。

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

蛍光ベースのカルシウム動員アッセイによるGタンパク質共役受容体のキャラクタリゼーション

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...