Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
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Agradecemos ao Instituto Nacional de Saúde (1R21CA138373 e Stand Up to Cancer (SU2C) para suporte financeiro deste trabalho. HY é grato para o Prêmio Elion 2009 da Associação Americana de Pesquisa do Câncer, o Prêmio Acadêmico Kimmel do Sidney Kimmel Fundação para a Cancer Research (SKF-08-101), e da National Science Foundation Faculdade Prémio Carreira precoce (NSF0954819).

1. Considerações sobre a clonagem <ol><li> Oligonucleotides comercialmente preparado representando o TMD de interesse ladeado por NheI e sítios de restrição BamHI e 5&#39;-fosforilada pode ser ligada em pTox7 (modificado em nosso laboratório pela inserção de um par de base logo após a restrição BamHI 14 sites) (Figura 3) digerida seqüencialmente com BamHI e NheI. Um oligonucleotídeo exemplo é mostrado abaixo: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &#39; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5&#39; </li></ol...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

O ensaio ToxR repórter transcricional é uma maneira fácil de identificar seqüências transmembrana com potencial para oligomerize. Uma vez que as interações estão ocorrendo dentro da membrana bacteriana interior, este ensaio contorna os problemas associados com a validade de sistemas de estudar na membrana-miméticos ambientes. Dado que a clonagem de DTM múltiplas em um único plasmídeo pode ser facilmente feito em paralelo eo ensaio completo pode ser realizado em formato de 96 poços da placa, este ensaio pode...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Enzima de restrição BamHI </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Enzimas Invitrogen foram encontrados para ser mais eficiente do que fornecedores alternativos </td></tr><tr><td> NheI enzima de restrição </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Enzimas Invitrogen foram encontrados para ser mais eficiente do que fornecedores alternativos </td></tr><tr><td> 15 mL tubos de cultura </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC media </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Feitas até o volume adequado e esterilizado em autoclave. </td></tr><tr><td> Media LB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Feitas até o volume adequado e esterilizado em autoclave. </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Solução estoque de 30 mg / mL em etanol armazenados em freezer </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Solução estoque de 2,5% (w / v) em água armazenado em freezer </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Chemicals </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sódio (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrofenil β-D-galactopiranosídeo (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Até perfazer 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 mL β-mercaptoetanol, 2 mL de clorofórmio, faz até 20 mL com Z-buffer. Vortex por 1 min centrífuga, por 1 min a 800 rpm. Faça frescos para cada prato. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS dissolvido em 10 mL Z-buffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG em 10 mL Z-buffer. Faça frescos para cada placa </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP anticorpo monoclonal (HRP conjugado) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Meio mínimo com maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x sais M9, maltose 0,4%, 1 mg / mL de tiamina, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> De 96 poços da placa de fundo chato </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Leitor de placas- </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Detector Multimodo </td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Agitação incubadora </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

A visão simplista de domínios transmembrana da proteína como meramente âncoras em bicamadas de fosfolipídios foi há muito refutada. Em muitos casos, membrana que mede as proteínas têm evoluído mecanismos altamente sofisticados de ação. Uma maneira 03/01 em que as proteínas da membrana são capazes de modular as suas estruturas e funções é por contato direto e específico de hélices hidrofóbicas, formando oligômeros transmembrana estruturado 4,5. Recentes Grande trabalho centrou-se na distribuição de aminoácidos preferencialmente encontrados no ambiente de membrana, em comparação com solução aquosa e as diferentes forças intermoleculares que a associação de unidade de proteína. 6,7 No entanto, os estudos de reconhecimento molecular no domínio transmembrana das proteínas ainda fica atrás dos solúvel em água regiões. Um grande obstáculo continua: apesar da especificidade e afinidade notável que oligomerização transmembrana pode atingir de 8 a medição direta de sua associação é um desafio. Metodologias tradicionais aplicadas ao estudo da função integrante da membrana da proteína pode ser dificultada pela insolubilidade inerente das sequências em análise. Percepções biofísicos adquirida com a estudar peptídeos sintéticos representando domínios transmembrana pode fornecer informações estruturais úteis. No entanto, a relevância biológica da micelar detergente ou sistemas de lipossomas utilizados nestes estudos para imitar membranas celulares é muitas vezes questionada; fazer peptídeos adotar uma estrutura semelhante à nativa nessas condições e não o seu comportamento funcional refletem verdadeiramente o modo de ação dentro de uma membrana nativa ? A fim de estudar as interações de seqüências transmembrana em bicamadas de fosfolipídeos naturais, o laboratório de ensaios desenvolvidos Langosch repórter ToxR transcricional. 9 domínios transmembrana O de interesse é expressa como uma proteína quimérica, com ligação às proteínas maltose de localização para o periplasma e ToxR a apresentar um relatório do nível de oligomerização (Figura 1). Na última década, vários outros grupos (por exemplo, Engelman, DeGrado, Shai) otimizados e aplicados neste ensaio repórter ToxR. 10-13 Os ensaios ToxR vários tornaram-se um padrão-ouro para testar interações proteína-proteína em membranas celulares. Nós aqui demonstrar uma operação típica experimental realizado em nosso laboratório que segue protocolos desenvolvidos principalmente por Langosch. Este método de aplicação geral é útil para a análise de transmembrana associação auto-domínio em E. coli, onde β-galactosidase de produção é utilizado para avaliar a propensão oligomerização DTM. Após a DTM induzida por dimerização, ToxR se liga ao promotor ctx causando aumento da regulação do gene LacZ para β-galactosidase. A leitura colorimétrica é obtida pela adição de ONPG às células lisados. Clivagem hidrolítica de ONPG pela β-galactosidase resulta na produção da espécie luz absorvendo o nitrophenolate (ORA) (Figura 2).

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Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Um procedimento eficiente para avaliar a propensão oligomerização de domínios de uma única passagem transmembrana (DTM) é descrito. Proteínas quiméricas que consiste na DTM fundido a ToxR são expressos em uma cepa de E. coli repórter. DTM induzida por oligomerização causas dimerização de ToxR, a ativação de transcrição e de produção da proteína repórter, galactosidase.

Transmembrana Propensão Oligomerização Domínio determinado pelo Assay ToxR

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biologia

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Caracterização de receptores acoplados à proteína G por um ensaio de fluorescência de mobilização de cálcio

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

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Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

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Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

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Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

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Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

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