Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Vi tackar National Institutes of Health (1R21CA138373 och Stand Up till Cancer (SU2C) för finansiellt stöd i detta arbete. HY är tacksam för 2009 Elion Award från American Association of Cancer Research, en Kimmel Scholar Award från Sidney Kimmel Stiftelsen för Cancer Research (SKF-08-101) och National Science Foundation fakulteten tidiga karriär Award (NSF0954819).

1. Kloning Överväganden <ol><li> Kommersiellt beredd oligonukleotider som representerar TMD intresse flankerad av NheI och BamHI platser restriktioner och 5&#39;-fosforyleras kan knyts ihop till pTox7 (modifierad i vårt laboratorium genom införande av ett baspar direkt efter BamHI begränsningen plats 14) (Figur 3) smält sekventiellt med BamHI och NheI. Ett exempel oligonukleotid visas nedan: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &quot; 3 &quot;gTMDSEQUENCEcctag5&quot; </li></ol><p class="jove_content...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

Den ToxR transkriptionell reporter-analysen är ett lättvindigt sätt att identifiera transmembrana sekvenser med potential att oligomerize. Eftersom interaktioner sker inom den bakteriella inre membranet, kringgår denna analys av frågor i samband med giltigheten av att studera system i membran-mimetiska miljöer. Med tanke på att kloning av flera TMDS i en enda plasmid lätt kan ske parallellt och hela analysen kan utföras i 96-brunnar format, kan detta test användas för hög genomströmning analys av stora män...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> BamHI restriktionsenzymanalys </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzymer visade sig vara mer effektiva än alternativa leverantörer </td></tr><tr><td> NheI restriktionsenzymanalys </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzymer visade sig vara mer effektiva än alternativa leverantörer </td></tr><tr><td> 15 ml provrör </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC medier </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Göras upp till lämplig volym och steriliseras i autoklav. </td></tr><tr><td> LB medier </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Göras upp till lämplig volym och steriliseras i autoklav. </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Stamlösning av 30 mg / ml i etanol förvaras i frys </td></tr><tr><td> Arabinos </td><td> Fluka </td><td> 10.839 </td><td> Stamlösning på 2,5% (w / v) i vatten som lagras i frysen </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Kemikalier </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 0,7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63.138 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium dodecylsulfate (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Nitrophenyl β-D-galaktopyranosid (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73.660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffert </td><td></td><td></td><td> 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Fyll upp till 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-merkaptoetanol, 2 ml kloroform, späd till 20 ml med Z-buffert. Vortex i 1 min, centrifugera i 1 min vid 800 rpm. Gör fräsch varje platta. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS upplöst i 10 ml Z-buffert </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG i 10 ml Z-buffert. Gör färska varje platta </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444.203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonal antikropp (HRP konjugerade) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Minimal media med maltos </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 salter, 0,4% maltos, 1 mg / ml tiamin, 2 mm MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-bra plan bottenplatta </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-läsare </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode Detector </td><td></td></tr><tr><td> Vattenbad </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Shaking inkubator </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

Den onyanserade bild av domäner protein transmembrana endast som ankare i fosfolipid bilayers sedan länge motbevisat. I många fall membran-spänner proteiner har utvecklats mycket sofistikerade verkningsmekanismer. 1-3 Ett sätt på vilket membranproteiner kan modulera deras strukturer och funktioner är av direkta och specifika kontakt hydrofoba helixar, som utgör strukturerade transmembranösa oligomerer. 4,5 Mycket senare Arbetet har fokuserat på distribution av aminosyror företrädesvis finns i membranet miljö jämfört med vattenlösning och de olika krafter intermolekylära som driver protein föreningen. 6,7 dock studier av molekylär igenkänning vid transmembrana domän proteiner fortfarande släpar efter de vattenlösliga regioner. Ett stort hinder kvarstår: Trots den märkliga specificitet och affinitet som transmembrane oligomerisering kan uppnå, är 8 direkt mätning av deras förening utmanande. Traditionella metoder tillämpas för att studera integrerade membranprotein funktion kan hämmas av den inneboende olöslighet av de sekvenser som granskas. Biofysiska insikter från att studera syntetiska peptider som representerar transmembrana domäner kan ge värdefull strukturell insikt. Men den biologiska relevansen av rengöringsmedel micellär eller liposomer som används i dessa studier för att efterlikna cellmembran ofta ifrågasatts, gör peptider anta en infödd-liknande struktur under dessa förhållanden och inte deras funktionella beteendet verkligen återspeglar verkningsmekanismen inom en infödd membran ? För att studera interaktioner mellan transmembrana sekvenser i naturliga fosfolipid bilayers utvecklade Langosch labbet ToxR transkriptionell reporter analyser. 9 det transmembrana domän av intresse uttrycks som en chimär protein med maltos bindande protein för plats till periplasm och ToxR att lämna en rapport av nivån på oligomerisering (Figur 1). Under det senaste decenniet har flera andra grupper (t.ex. Engelman, DeGrado, Shai) optimeras ytterligare och tillämpat denna analys ToxR reporter. 10-13 De olika ToxR-analyser har blivit en guldmyntfot att testa protein-protein interaktioner i cellmembranen. Vi visar här ett typiskt experimentell verksamhet bedrivs i vårt laboratorium som i första hand följer protokoll som utvecklats av Langosch. Denna allmängiltig metod är användbar för analys av transmembrana domän själv-förening i E. coli, där β-galaktosidas produktionen används för att bedöma TMD oligomerisering benägenhet. Vid TMD-inducerad dimerization, binder ToxR till ctx promotor orsakar uppreglering av LacZ genen för β-galaktosidas. En kolorimetrisk avläsning erhålls genom tillsats av ONPG till lyzed celler. Hydrolytisk klyvning av ONPG av β-galaktosidas resultat i produktionen av ljusabsorberande arter o-nitrophenolate (ONP) (Figur 2).

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Ett effektivt förfarande för att bedöma oligomerisering benägenhet enpassage transmembrana domäner (TMDS) beskrivs. Chimär proteiner bestående av TMD smält till ToxR uttrycks i en E. coli-reporter stam. TMD-inducerad oligomerisering orsaker dimerization av ToxR, aktivering av transkription och produktion av reportern protein-galaktosidas.

Transmembrana Domain oligomerisering Benägenhet bestäms av ToxR analys

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression och rening av den cystisk fibros transmembran konduktans-regulator protein i Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Rening av cystisk fibros transmembran konduktansregulator Protein Uttryckt i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Karaktärisering av G-proteinkopplade receptorer av en fluorescensbaserad kalciummobilisering Assay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genomvid Protein-proteininteraktion Screening av Protein-fragment kompletteringsanalys (PCA) i levande celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Beredning av ett transmembranprotein, den spänningskänsliga jonkanaler, KvAP, in Giant enlamellvesiklar för mikroskopi och Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optisk Kartläggning av Intra-sarkoplasmatiska retiklet Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Och transmembranpotentialen i Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analys: Icke-invasiv Adrenal Övervakning av equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetiska och biokemiska metoder för<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Bedömning av Protein Oligomerisering: ryanodin Receptor Fallstudie

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studie av endoplasmatiskt retikulum och Mitochondria Interaktioner av<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay i fixerade celler

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...