Name: transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Biz, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R21CA138373 teşekkür ediyor ve bu çalışmanın finansal destek Kanseri (SU2C) Stand Up. HY, Amerikan Kanser Araştırma, Sidney Kimmel Vakfı Kimmel Scholar Ödülü Derneği, 2009 Elion Ödülü için minnettar Kanser Araştırma (SKF-08-101) ve Ulusal Bilim Vakfı Fakültesi Erken Kariyer Ödülü (NSF0954819).

1. Klonlama Hususlar <ol><li> Ticari olarak hazırlanan oligonükleotidler NheI ve BamHI kısıtlama siteleri ve 5&#39;-fosforile ile çevrili ilgi TMD temsil pTox7 (BamHI kısıtlama sitesi 14 doğrudan sonra tek bir baz çifti ekleme laboratuvarımızda güncellenmiştir) (Şekil 3) sırayla sindirilir içine bağlandı . BamHI ve NheI. Bir örnek oligonükleotid, aşağıda gösterilmiştir: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &#39; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5&#39; </li></ol> TMD...

<ol>
	<li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors:+a+case+for+association+using+transmembrane+helices.">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li><li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease.">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li><li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li><li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase.">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li><li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg(2+)-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg(2+)+homeostasis.">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li><li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures.">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li><li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+into+membranes.">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li><li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane.">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li><li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p., Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator.">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li><li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TOXCAT:+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane.">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li><li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association.">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li><li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions.">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li><li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains:+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins.">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li><li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene,+latent+membrane+protein+1.">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , (2010).</li><li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes.">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li><li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper.">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li><li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions.">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li></ol>

ToxR transkripsiyonel muhabiri tahlil oligomerize potansiyeline sahip transmembran dizileri tanımlamak için uyduruk bir yoludur. Bakteriyel iç zarı içinde meydana gelen etkileşimler olduğundan, bu testte membran-mimetik ortamlarda eğitim sistemlerinin geçerliliği ile ilgili konular circumvents. Paralel olarak tek bir plazmid birden çok TMDS klonlama kolayca yapılabilir ve tüm testi 96-plaka biçiminde yapılabilir göz önüne alındığında, bu testte yüksek verimlilik analizi için çok sayıda protein ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> BamHI restriksiyon enzimi </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi </td></tr><tr><td> NheI restriksiyon enzimi </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi </td></tr><tr><td> 15 ml kültür tüpleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC medya </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. </td></tr><tr><td> LB medya </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Dondurucuda saklanan etanol içinde 30 mg / mL stok çözelti </td></tr><tr><td> Arabinoz </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Dondurucuda saklanan su,% 2,5 (w / v) stok solüsyonu </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Kimyasallar </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodecylsulfate (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrofenil β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16.1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 1 lt, pH 7.0 Makyaj </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-mercaptoethanol, 2 mL kloroform, Z-buffer ile 20 ml kadar yapmak. 800 rpm&#39;de 1 dakika için 1 dakika, santrifüj Vortex. Her plaka için taze olun. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS 10 ml Z-tampon içinde çözünmüş </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg 10 ml Z-tampon ONPG. Her plaka için taze olun </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonal antikor (HRP konjuge) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Maltoz ile Minimal medya </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 tuzlar,% 0.4 maltoz, 1 mg / ml tiamin, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-düz alt plakası </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Levha okuyucu </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode Dedektörü </td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Inkübatör Çalkalamalı </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

Çürütülmüştür beri protein transmembran etki basitleştirilmiş görünüm olarak sadece fosfolipid bilayers çapa uzun. Birçok durumda membran kapsayan proteinler eylem oldukça sofistike mekanizmaları gelişmiştir. Membran proteinleri, yapıları ve işlevleri modüle 1-3 hangi bir yolu yapılandırılmış transmembran oligomerler oluşturan, hidrofobik heliksler ve özel direkt temas 4,5 Kadar son tercihen sulu çözelti ve sürücü protein dernek. 6,7 Bununla birlikte, transmembran proteinlerinin etki moleküler tanıma çalışmaları hala gerisinde kalıyor bu farklı moleküller arası kuvvetler karşılaştırma membran ortamda bulunan amino asitlerin dağıtım odaklandı suda çözünen bölgeler. Büyük bir engel kalır: transmembran oligomerization elde edebilirsiniz olağanüstü spesifite ve afinite rağmen, kendi dernek 8 doğrudan ölçümü zordur. Integral membran proteini fonksiyon çalışmaya uygulanan geleneksel metodolojiler inceleme altında dizilerinin doğasında çıkılmazlık engel olabilir. Transmembran etki alanlarını temsil eden sentetik peptidlerin inceleyerek elde Biyofiziksel anlayışlar yararlı yapısal içgörü sağlayabilir. Ancak, deterjan misel veya hücre zarının taklit etmek için bu çalışmalarda kullanılan lipozom sistemleri biyolojik önemi sık sık sorgulanmaktadır; peptidler, bu koşullar altında anadili gibi bir yapı benimsiyor ve bunların fonksiyonel davranış, gerçekten yerli bir membran içinde eylem türü yansıtıyor mu ? Transmembran dizilerinin doğal fosfolipid bilayers etkileşimleri incelemek üzere, Langosch laboratuar ToxR transkripsiyonel muhabiri deneyleri geliştirdi. 9 transmembran ilgi alanı periplasm ve ToxR konumu, maltoz bağlayıcı protein ile bir kimerik protein olarak ifade edilir bir rapor sunmak oligomerization düzeyi (Şekil 1). Son on yıl içinde, diğer bazı gruplar (örneğin Engelman, DeGrado, Shai) daha da optimize ve bu ToxR muhabiri tahlil uygulanan 10-13 çeşitli ToxR deneyleri, hücre zarlarında protein-protein etkileşimleri test etmek için bir altın standart haline gelmiştir . Biz burada öncelikle Langosch tarafından geliştirilen protokoller aşağıdaki laboratuvarda yapılan tipik bir deneysel çalışma göstermektedir. Bu genellikle uygulanan yöntem E. transmembran alan öz-dernek analizi için yararlı coli, β-galaktosidaz üretim TMD oligomerization eğilimi değerlendirmek için kullanılır. TMD indüklenen dimerization üzerine, ToxR β-galaktosidaz LacZ gen up-regülasyonu neden ctx organizatörü bağlar. Kolorimetrik okuma kazandaki süreçlerin hücreleri ONPG eklenmesi ile elde edilir. Işık emici türleri o nitrophenolate (ONP) (Şekil 2) üretimini β-galaktosidaz sonuçları ONPG hidrolitik bölünme.

Watch this Scientific Journal Video about Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay at JoVE.com

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

Research

JoVE Journal

Biology

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...