Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وDK074656 AI56374 (CEM) ، وكذلك مؤسسة أبحاث السكري الأحداث.

1. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هدف الخلية الثقافة : الثقافة وكان من خطوط الماوس خلايا بيتا ، وNIT 1 - 4 - NIT ، وهو 1،2 الموصوفة سابقا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 0.02 ٪ BSA ، غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 15mM HEPES ، 16.5mM Glocose والبنسلين / الستبرتو?...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

السامة للخلايا T في خلايا بيتا بوساطة الموت هو الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية للT1D 5. المقايسات CML باستخدام الكروم اطلاق سراح 51 تسمح لنا دراسة درجة المستجيب المستهدفة استجابة 6. ومع ذلك ، لا تزال عملية مفصلة والممرات من الخلايا T التي تتوسط بيتا موت الخ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td> بيركن إلمر </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> تسلسل الأحماض الأمينية : YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار مصل الزلال </td><td> سيغما </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060 - CL </td><td></td></tr><tr><td> MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> الجوزاء </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> الفينول الحمراء الخالية DMEM </td><td> سيغما </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 حاضنة </td><td> الحرارية فيشر </td><td> HeraCell 150i </td><td> أبقى العقيمة للثقافة الخلية </td></tr><tr><td> السلامة البيولوجية لمجلس الوزراء </td><td> الحرارية فيشر </td><td> تقديرية 1440 </td><td></td></tr><tr><td> ثقافة أنابيب القابل للتصرف ، 6x50 زجاج الجير ملم </td><td> الصياد </td><td> 14-958 - A </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة غاما </td><td> بيركن إلمر </td><td> المعالج 1470 عداد غاما التلقائية </td><td></td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> زايس </td><td> LSM 510 ميتا متحد البؤر </td><td> مع مرحلة بمحركات والعيش غرفة الخلية </td></tr><tr><td> ماصة (1ml ، 200μl ، 20μl ، 10μl ، 2μl) </td><td> إيبندورف </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أنابيب (العنبر) </td><td> الصياد </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> Sorvall الأيقونات RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> فيشر العلمية </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> تستقيم مجهر </td><td> زايس </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران </td><td> مختبر جاكسون </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران </td><td> مختبر جاكسون </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD - AI4α / الفئران F1 β </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> الحيوانات المرباة في منشأة UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

داء السكري نوع 1 (T1D) هي الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية تي. خلال المرضية ، والمرضى تصبح تدريجيا أكثر ناقص الأنسولين كما هو فقدان إنتاج الأنسولين ، ويفترض أن هذه النتائج من تدمير خلايا بيتا في البنكرياس من قبل خلايا تي. وفهم آليات موت الخلايا بيتا خلال تطوير T1D تقديم رؤى لإنشاء علاج فعال لهذا المرض. وقد استخدمت الخلية بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات تاريخيا النويدات المشعة الكروم 51 (51 ريال برازيلي) إلى تسمية الخلايا المستهدفة. ثم تتعرض هذه الأهداف إلى الخلايا المستجيب وقراءة الافراج عن 51 ساعة معتمدة من الخلايا المستهدفة كدليل على موت الخلايا اللمفاوية التي تتوسط فيها. مثبطات نتيجة موت الخلايا في الافراج انخفضت من 51 ساعة معتمدة. كما الخلايا المستجيب ، استخدمنا تنشيط السكان نسيلي autoreactive من CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية (CTL) معزولة عن ماوس وراثيا الأسهم للألفا على حد سواء وسلاسل بيتا من مستقبلات الخلايا التائية AI4 (TCR). وتم تنشيط خلايا تي AI4 التعاون مع مثقف 51 ساعة معتمدة المسمى الخلايا المستهدفة NIT لمدة 16 ساعة ، والإفراج عن 51 ساعة معتمدة تم تسجيلها لحساب تحلل محددة الميتوكوندريا المشاركة في العديد من الأحداث الفيزيولوجية الهامة ، مثل إنتاج الطاقة ، وتنظيم الإشارات تنبيغ ، وموت الخلايا المبرمج. دراسة التغييرات الوظيفية الميتوكوندريا خلية بيتا خلال تطوير T1D هي منطقة جديدة من الأبحاث. باستخدام غشاء الميتوكوندريا المحتملة صبغة رباعي ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) ، والتصوير المجهري مبائر الخلية الحية ، رصدنا غشاء الميتوكوندريا المحتملة على مر الزمن في خط خلايا بيتا NIT - 1. للدراسات والتصوير ، وكانت تسمى الخلايا التائية المستجيب AI4 مع صبغة الفلورسنت النووية تلطيخ Picogreen. NIT - 1 الخلايا والخلايا التائية وشارك في تربيتها في غرف ساترة والتي شنت على المسرح المجهر مجهزة غرفة الخلية الحية ، التي تسيطر على 37 درجة مئوية ، مع 5 ٪ CO 2 ، ومرطب. خلال هذه التجارب تم التقاط صور من كل مجموعة كل 3 دقائق لمدة 400 دقيقة. أكثر من 400 دورة دقائق ، لاحظنا تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا في NIT - 1 كتل الخلية حيث كانت تعلق AI4 خلايا تي. في التجربة التحكم في وقت واحد حيث تم NIT - 1 الخلايا المستزرعة التعاون مع MHC سوء المتطابقة ظلت الميتوكوندريا المحتملة غشاء خلايا لمفاوية Jurkat ، سليمة. ويمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة التغييرات في الوقت الحقيقي في غشاء الميتوكوندريا المحتملة في الخلايا الليمفاوية تحت هجوم السامة للخلايا ، السيتوكينات ، أو الكواشف السامة للخلايا أخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

ويمكن استخدام الخلايا بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات لاختبار ردود الفعل وآليات autoreactive دراسة موت الخلايا في المختبر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الخلايا الحية المجهرية مبائر تقنيات التصوير مع الأصباغ الفلورية ، اكتب وحركية من موت الخلايا وكذلك الممرات المستخدمة في دراستها بمزيد من التفصيل.

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

تحديد نشاط السامة للخلايا الأمثل للHer2neu CD8 خلايا تي محددة الإنسان من خلال مقارنة الفحص الإصدار Cr51 إلى نظام xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

إنتشار الجزيئي في أغشية البلازما الخلايا اللمفاوية الابتدائية تقاس الإسفار الارتباط الطيفي

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...