Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de DK074656 AI56374 (CEM), ainsi que la Juvenile Diabetes Foundation Research.

1. Préparation des cellules <ol><li> Culture de cellules cibles: la culture de lignées de souris des cellules bêta, NIT-1-4 et aux NTIC, a été un 1,2 précédemment décrit dans DMEM supplémenté avec 10% de FBS, BSA 0,02%, non-acides aminés essentiels, 15mm HEPES, 16.5mm Glocose et pénicilline / streptomycine. Pour 51 d&#39;étiquetage Cr, les cellules des graines dans un fond plat plaque de 96 puits de culture au 5X10 4 cellules / puits dans 200 ul milieu de culture. Pour des...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Lymphocyte T cytotoxique médiée la mort des cellules bêta est la principale physiopathologie du DT1 5. Dosages de LMC en utilisant 51 Cr communiqué nous permettre d&#39;étudier le degré d&#39;effecteur-cible de réponse 6. Cependant, le processus détaillé et les voies de lymphocytes T de mort des cellules bêta n&#39;est pas encore pleinement comprise. Depuis les mitochondries sont critiques pour la fonction des cellules bêta et la mort 7, nous nous sommes concentrés...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tétraméthyl rhodamine ester méthylique (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> séquence d&#39;acides aminés: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM non-acides aminés essentiels </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gemini </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Le rouge de phénol DMEM sans </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Maintenu stérile pour la culture cellulaire </td></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Des tubes de culture jetables, 6x50 mm verre à la chaux </td><td> Fisher </td><td> 14 à 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Compteur gamma </td><td> Perkin Elmer </td><td> Assistant 1470 compteur gamma automatique </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta confocale </td><td> Avec platine motorisée et la chambre de cellules vivantes </td></tr><tr><td> Pipette (1ml, 200 pl, 20 pi, 10 pi, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes (Ambre) </td><td> Fisher </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hémacytomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β souris F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Elevé en animalerie UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune cellulaire T. Pendant la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopenic que la production d&#39;insuline est perdu, sans doute cela résulte de la destruction des cellules bêta du pancréas par les lymphocytes T. Comprendre les mécanismes de la mort des cellules bêta au cours du développement du DT1 donneront un aperçu de générer un remède efficace contre cette maladie. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages ont toujours utilisé le radionucléide chrome 51 (51 Cr) pour marquer les cellules cibles. Ces objectifs sont ensuite exposés à des cellules effectrices et la libération de 51 Cr par les cellules cibles est lu comme une indication de la mort cellulaire médiée par les lymphocytes. Les inhibiteurs de la mort cellulaire résulte de la libération diminué de 51 Cr. Comme les cellules effectrices, nous avons utilisé une population active autoréactifs clonale de cellules CD8 + lymphocytes T cytotoxiques (CTL) isolés à partir d&#39;un stock de souris transgéniques pour les deux chaînes alpha et bêta du récepteur AI4 cellules T (TCR). Activé AI4 cellules T ont été co-cultivées avec des cellules marquées au 51 Cr NIT cible pendant 16 heures, la libération de 51 Cr a été enregistré pour calculer lyse spécifique Les mitochondries participent à de nombreux événements importants physiologiques, tels que la production d&#39;énergie, la régulation de la signalisation de transduction, et l&#39;apoptose. L&#39;étude des cellules bêta mitochondriale changements fonctionnels pendant le développement du DT1 est un nouveau domaine de recherche. Utiliser le potentiel de membrane mitochondriale colorant rhodamine tétraméthyl ester méthylique (TMRM) et l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes microscopiques, nous avons suivi le potentiel de membrane mitochondriale au cours du temps dans la ligne de la cellule bêta-1 NIT. Pour les études d&#39;imagerie, d&#39;effecteur AI4 cellules T ont été marqués avec fluorescent nucléaire coloration colorants Picogreen. NTI-1 et les cellules T ont été co-cultivées en chambrée lamelle et monté sur la platine du microscope équipé d&#39;une chambre de cellules vivantes, contrôlée à 37 ° C, avec 5% de CO 2, et humidifié. Lors de ces expériences images ont été prises de chaque cluster toutes les 3 minutes pour 400 minutes. Pendant une période de 400 minutes, nous avons observé la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale dans NIT-1 grappes cellule où AI4 cellules T ont été attachés. Dans l&#39;expérience, où le contrôle simultané NIT-1 cellules ont été co-cultivées avec CMH dépareillés humaine cellules Jurkat lymphocytes, le potentiel de membrane mitochondriale est resté intact. Cette technique peut être utilisée pour observer en temps réel des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules de l&#39;attaque des lymphocytes cytotoxiques, des cytokines, ou d&#39;autres réactifs cytotoxiques.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d&#39;imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

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