Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.

1. הכנת התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא היעד תרבות: תרבות של בטא עכבר שורות תאים, ניט-1 ו אנבה-4, היה 1,2 תיאר בעבר DMEM בתוספת 10% FBS, BSA 0.02%, שאינן חיוניות חומצות אמינו, 15mm HEPES, 16.5mM Glocose ו פניצילין / סטרפטומיצין. במשך 51 תיוג Cr, בתאי הזרע צלחת ש?...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> CR-51 </td><td> פרקין אלמר </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> רצף חומצות אמינו: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> ממ שאינם חיוניים חומצות אמינו </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> מזל תאומים </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום ללא DMEM </td><td> סיגמא </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> החממה CO2 </td><td> תרמו פישר </td><td> HeraCell 150i </td><td> שמרו סטרילי עבור תרבית תאים </td></tr><tr><td> בטיחות ביולוגית הממשלה </td><td> תרמו פישר </td><td> פורמה 1440 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות צינורות פנויה, 6x50 מ&quot;מ זכוכית ליים </td><td> דיג </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> גמא מונה </td><td> פרקין אלמר </td><td> אשף אוטומטי 1470 מונה גמא </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> עם הבמה ממונע תא תא חי </td></tr><tr><td> פיפטה (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צינורות (אמבר) </td><td> דיג </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> Sorvall מקרא RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemacytometer </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים </td><td> ג&#39;קסון מעבדה </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / עכברים F1 β </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Bred במתקן חיה UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr. כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות. במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי - התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

קביעת פעילות ציטוטוקסית אופטימלית של CD8 תאי T ספציפי אדם Her2neu על ידי השוואת Assay שחרור Cr51 למערכת xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...