Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
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この作品は、健康DK074656とAI56374（CEM）の国立研究所からの補助金だけでなく、若年性糖尿病研究財団によってサポートされていました。

1。細胞の調製<ol><li>標的細胞培養：マウスのβ細胞株、NIT - 1及びNIT - 4の培養は、10％FBS、0.02％BSA、非必須アミノ酸、15mmのHEPES、16.5を含むDMEMで前に説明した1,2だったGlocoseおよびペニシリン/ストレプトマイシン。 5 × 10 4細胞で平底96穴培養プレートの51 Crのラベル、種子の細胞/ウェル200μlの培養培地中のため。顕微鏡実験、500μlの培養培地中のチャンバーあたり5 × ...

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	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

細胞傷害性T細胞を介したβ細胞死は、T1D 5の主な病態である。 51 Cr放出を用いたCMLアッセイは、私たちはエフェクター-ターゲットの反応6の度合いを調べることができます。しかし、詳細なプロセスと、T細胞媒介性のβ細胞死の経路はまだ完全には理解されていない。ミトコンドリアは、β細胞機能と死7の重要なので、我々は、視覚的なCMLの間にミトコンドリ?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> CR - 51 </td><td>パーキンエルマー</td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM） </td><td>インビトロジェン</td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td>インビトロジェン</td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td>アミノ酸配列：YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL - 2 </td><td> R＆D </td><td> 485 - MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25から060 - Clを</td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸</td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>双子座</td><td> 400から109 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないDMEM </td><td>シグマ</td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2インキュベータ</td><td>サーモフィッシャー</td><td> HeraCell 150i </td><td>細胞培養用の滅菌保管</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>フォーマ1440 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨て文化のチューブ、6x50 mm黄ガラス</td><td>フィッシャー</td><td> 14から958 - </td><td></td></tr><tr><td>ガンマカウンタ</td><td>パーキンエルマー</td><td>ウィザード1470自動ガンマカウンター</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> LSM 510共焦点メタ</td><td>電動ステージと生細胞のチャンバーで</td></tr><tr><td>ピペット（1ミリリットル、200μlの、20μlの、10μlの、2μlの） </td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ（アンバー） </td><td>フィッシャー</td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>ソーバルレジェンドRT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcraAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg - RAG1 tm1Mom TG（TcrbAI4）1Dvs/DvsJマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD -AI4α/βF1マウス</td><td> N / </td><td> N / </td><td>フロリダ大学の動物施設で飼育</td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

1型糖尿病（T1D）は、T細胞媒介性自己免疫疾患である。インスリン産生が失われると病因の間に、患者は、T細胞による膵β細胞の破壊から、おそらくこの結果は、次第にinsulinopenicになる。 T1Dの開発中にベータ細胞死のメカニズムを理解することはこの病気のための効果的な治療法を生成するための洞察を提供します。細胞媒介lymphocytotoxicity（CML）アッセイは、歴史的に標的細胞を標識する放射性核種クロム51（51 Cr）を使用している。これらのターゲットは、エフェクター細胞に曝露されており、標的細胞からの51 Crの放出は、リンパ球が介在する細胞死の指標として読み込まれます。 51 Crの減少のリリースでは細胞死の結果の阻害剤。 エフェクター細胞として、我々はAI4 T細胞受容体（TCR）のαとβ鎖の両方のためのマウスの株式のトランスジェニックから分離されたCD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の活性化自己反応性クローン集団を使用する。活性化さAI4 T細胞が16時間の51 Cr標識標的NITの細胞と共培養された、51 Crの放出は、特異的溶解を計算するために記録されたミトコンドリアなどのエネルギー生産、伝達をシグナル伝達の調節、およびアポトーシスなどの多くの重要な生理学的なイベントに参加。 T1Dの開発中のベータ細胞のミトコンドリアの機能変化の研究は、研究の新たな領域です。ミトコンドリア膜電位色素テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と共焦点顕微鏡、ライブセルイメージングを使用して、我々は、β細胞株NIT - 1で時間をかけてミトコンドリア膜電位をモニターする。イメージング研究のために、エフェクターAI4 T細胞は、蛍光核染色色素Picogreenで標識した。 NIT - 1細胞とT細胞はチャンバーカバーガラスで共培養し、生細胞のチャンバーを装備した顕微鏡ステージに搭載された、37℃に制御された° C、5％CO 2、及び加湿付き。これらの実験中にイメージは、各クラスタから400分毎に3分を採取した。 400分のコースで、我々はAI4 T細胞が接続されていたNIT - 1細胞​​クラスターのミトコンドリア膜電位の散逸を観察した。 NIT - 1細胞​​はMHCの不整合ヒトリンパ球Jurkat細胞と共培養した同時対照実験では、ミトコンドリアの膜電位はそのまま残った。この手法は、細胞傷害性リンパ球、サイトカイン、または他の細胞毒性試薬の攻撃を受けて細胞内のミトコンドリア膜電位のリアルタイムの変化を観察するために使用することができます。

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

細胞媒介のlymphocytotoxicity（CML）アッセイは、in vitroにおける自己反応性応答と細胞死の研究のメカニズムをテストするために使用することができます。しかし、蛍光染料、型と細胞死だけでなく、利用経路の動態と生きた細胞の共焦点顕微鏡イメージング技術を用いてより詳細に調べることができる。

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...