Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
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Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e DK074656 AI56374 (CEM), bem como o Juvenile Diabetes Research Foundation.

1. Preparação de células <ol><li> Cultura de células alvo: Cultura do mouse linhas de células beta, NIT-1 e NIT-4, foi um 1,2 descrito anteriormente em DMEM suplementado com 10% de SFB, BSA 0,02%, não-essenciais Aminoácidos, 15mM HEPES, 16.5mm Glocose e penicilina / estreptomicina. Por 51 Cr rotulagem, as células de semente em um flat-bottom de 96 poços na placa de cultura 5X10 4 células / poço em 200 mL meio de cultura. Para experimentos de microscopia, as células de semen...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Citotóxica de células T morte celular mediada beta está a fisiopatologia das principais DM1 5. CML ensaios utilizando 51 Cr lançamento nos permitem estudar o grau de meta-efetoras de resposta 6. No entanto, o processo detalhado e os caminhos da morte das células T mediada por células beta ainda não é totalmente compreendido. Uma vez que as mitocôndrias são críticos para a função das células beta ea morte 7, centrada em mudanças mitocondrial durante a CML visual....

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrametil Rodamina Methyl Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> seqüência de aminoácidos: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-Aminoácidos Essenciais </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gêmeos </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Vermelho de fenol livre de DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadora de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Mantido estéril para cultura de células </td></tr><tr><td> Cabines de segurança biológica </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Descartáveis ​​tubos de cultura, 6x50 milímetros de vidro Lime </td><td> Pescador </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Contador gama </td><td> Perkin Elmer </td><td> Assistente de contador gama automático 1470 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta Confocal </td><td> Com estágio motorizado e câmara de células vivas </td></tr><tr><td> Pipeta (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos (Amber) </td><td> Pescador </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio na posição vertical </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos </td><td> O Laboratório de Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Ratos </td><td> O Laboratório de Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β camundongos F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF criados em instalações para animais </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença mediada por células T auto-imunes. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopenic como a produção de insulina está perdido, presumivelmente, o que resulta da destruição das células beta pancreáticas pelas células T. Compreensão dos mecanismos de morte das células beta durante o desenvolvimento do DM1 irá fornecer informações para gerar uma cura eficaz para esta doença. Mediada por células linfocitotoxicidade (CML) ensaios têm historicamente utilizado o Chromium radionuclídeos 51 (51 Cr) para rotular as células-alvo. Estas metas são, em seguida, expostos a células efetoras e da liberação de 51 Cr a partir de células-alvo é lido como uma indicação de linfócitos mediada por morte celular. Inibidores de resultado morte celular na liberação diminuída de 51 Cr. Como células efetoras, usamos uma população autoreactive ativado clonal de linfócitos CD8 + T citotóxicas (CTL) isolado de um camundongo transgênico estoque para ambas as cadeias alfa e beta do receptor de células T AI4 (TCR). Ativado AI4 células T foram co-cultivados com células-alvo 51 Cr rotulados NIT por 16 horas, a liberação de 51 Cr foi gravado para calcular a lise específica Mitocôndrias participar em muitos eventos fisiológicos importantes, como a produção de energia, regulação da transdução de sinalização e apoptose. O estudo da célula beta mitocondrial alterações funcionais durante o desenvolvimento do DM1 é uma área nova de pesquisa. Usando o potencial de membrana mitocondrial corante Rodamina Tetrametil Methyl Ester (TMRM) e imagens de células microscópicas confocal vivemos, nós monitorados potencial de membrana mitocondrial ao longo do tempo na linha da célula beta NIT-1. Para exames de imagem, AI4 células T efectoras foram marcadas com o corante fluorescente coloração nuclear Picogreen. NIT-1 e células T foram co-cultivados em câmaras lamínula e montado sobre o palco microscópio equipado com uma câmara de células vivas, a 37 ° C, com 5% de CO 2, e umidificado. Durante esses experimentos imagens foram tiradas de cada cluster a cada 3 minutos para 400 minutos. Mais de um curso de 400 minutos, observou-se a dissipação do potencial de membrana mitocondrial em NIT-1 grupos de células, onde AI4 células T foram anexados. No experimento controle simultâneo onde NIT-1 as células foram co-cultivados com MHC desencontradas células Jurkat linfócitos, potencial de membrana mitocondrial permaneceu intacta. Esta técnica pode ser usada para observar em tempo real as mudanças no potencial de membrana mitocondrial em células sob ataque de linfócitos citotóxicos, citocinas, ou outros reagentes citotóxicos.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados ​​para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.

Métodos para avaliar Mediated Beta Morte celular por linfócitos T citotóxicos

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Imunologia e Infecção

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

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Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Difusão molecular em membranas plasmáticas de linfócitos primários medida por fluorescência Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Quantificação rápida de blastogénese induzida por Mitogénio em linfócitos T para identificar drogas imunomoduladoras

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Um método para avaliar funções efetoras mediada por Fc induzidas por anticorpos específicos de hemaglutinina de gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...