Name: methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes
Uploaded: 2011-06-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Bu çalışmanın yanı sıra, National Institutes of Health DK074656 ve AI56374 (CEM) hibe Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. Hücrelerin hazırlanması <ol><li> Hedef hücre kültürü: Kültür fare beta hücre hatları, NIT-1 ve NIT-4,% 10 FBS,% 0.02 BSA, Non-esansiyel amino asit, 15mm Hepes, 16.5mm ile desteklenmiş DMEM önceden açıklanan 1,2 oldu Glocose ve Penisilin / Streptomisin. 5x10 4 hücre düz bir alt 96-kuyu kültür plaka 51 Cr etiketleme, tohum hücreleri / 200 ul kültür ortamı iyi. Mikroskopi deneyler, 500 ul kültür ortamı oda başına 5x10 4 8-iyi Lab-Tak II odacıklı...

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Sitotoksik T hücre aracılı beta hücre ölümü T1D 5 ana patofizyolojisi. 51 Cr sürümü kullanarak KML testleri bize efektör-hedef yanıt 6 derecesini incelemek için izin verir. Ancak, ayrıntılı bir süreç ve T hücre-aracılı beta hücre ölümü yolları hala tam olarak anlaşılmış değildir. Mitokondri, beta hücre fonksiyonu ve ölüm 7 için kritik olduğundan, görsel KML sırasında mitokondrial değişiklikler üzerine odaklanmıştır . Mitokondrial za...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> amino asit dizilimi: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Ar-Ge </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-Essential Amino Asitler </td><td> Gibco </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> İkizler burcu </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol kırmızı ücretsiz DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> CO2 İnkübatör </td><td> Thermo Fisher </td><td> HeraCell 150i </td><td> Hücre kültürü için steril Kept </td></tr><tr><td> Biyolojik güvenlik kabini </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Tek kullanımlık kültür tüpleri, 6x50 mm Kireç Cam </td><td> Balıkçı </td><td> 14-958-A </td><td></td></tr><tr><td> Gama Sayıcı </td><td> Perkin Elmer </td><td> Wizard 1470 Otomatik Gama Sayıcı </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> EKK 510 Meta Konfokal </td><td> Motorlu sahne ve canlı hücre odasına </td></tr><tr><td> Pipet (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borular (Sarı) </td><td> Balıkçı </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Dik Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Fare </td><td> Jackson Laboratuvarı </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β F1 fareler </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> UF hayvan tesisi yetiştirilen </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Tip 1 diyabet (T1D) T hücre aracılı otoimmün hastalık. Patogenezinde sırasında, hastaların insülin üretimi kayıp olarak T hücreleri tarafından pankreas beta hücrelerinin yıkımını muhtemelen bu sonuç, giderek daha insulinopenic hale gelir. T1D gelişimi sırasında beta hücre ölüm mekanizmaları anlamak, bu hastalık için etkili bir çare üretmek için anlayışlar sağlayacaktır. Hücre aracılı lenfositotoksisite (KML) testlerin tarihsel hedef hücreleri etiket radyonüklid Krom 51 (51 Cr) kullanılır. Bu hedefler daha sonra efektör hücreleri maruz kalan ve 51 Cr hedef hücrelerden serbest bırakılması lenfosit aracılı hücre ölümü bir göstergesi olarak okunur . 51 Cr azalmış serbest hücre ölümü sonucu inhibitörleri. Efektör hücreler olarak, CD8 aktive otoreaktif klonal nüfus + AI4 T hücre reseptör (TCR) alfa ve beta zincirleri için bir fare stok transgenik izole Sitotoksik T lenfositler (CTL) kullanılır. Aktif AI4 T hücreleri 16 saat boyunca 51 Cr etiketli hedef NIT hücreleri birlikte kültür, serbest bırakılması 51 Cr belirli lizis hesaplamak için kaydedildi Mitokondri, enerji üretimi, sinyal transdüksiyon düzenlenmesi ve apoptosis gibi birçok önemli fizyolojik olaylar, katılırlar. T1D gelişimi sırasında beta hücre mitokondrial fonksiyonel değişiklikler çalışma, bir araştırma roman alanıdır. Mitokondriyal membran potansiyeli boya tetramethyl rodamin Metil Ester (TMRM) ve konfokal mikroskobik canlı hücre görüntüleme kullanarak, beta hücre hattı NIT-1 mitokondrial membran potansiyeli zaman içinde izlenmektedir. Görüntüleme çalışmaları için, efektör AI4 T hücreleri floresan nükleer boyanma boya Picogreen etiketli. NIT-1 ve T hücreleri odacıklı coverglass ortak kültür ve canlı bir hücre odası ile donatılmış mikroskop aşamasında üzerine monte edilmiş, 37 kontrol edildi ° C,% 5 CO 2 ve nemlendirilmelidir. Bu deneyler sırasında görüntüleri her küme her 3 dakikada bir 400 dakika alındı. 400 dakika boyunca, biz AI4 T hücreleri bağlı NIT-1 hücre kümeleri mitokondrial membran potansiyeli dağılımı görülmektedir. NIT-1 hücreleri MHC ile birlikte kültüre edildi eşzamanlı kontrol deneyde yanlış uyumlu insan lenfosit Jurkat hücreleri, mitokondriyal membran potansiyeli bozulmadan kalabilmiş. Bu teknik, sitotoksik lenfosit, sitokinler, veya diğer sitotoksik reaktifler saldırı altında hücreleri mitokondrial membran potansiyeli gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes at JoVE.com

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Radyal Hareket ve retroviral replike olan bir vektör transduse, Yapışmayan Alloresponsive T lenfositlerinin sitotoksik işlev

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...