Name: live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

كان مدعوما من قبل SL الزمالة من DFG (مدرسة عليا للبحوث 845). وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من (530/C1 SFB ول967) DFG وHOMFOR.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li><li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+form+ER+Ca2++leak+channels,+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer's+disease-linked+mutations.">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li><li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation.">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li><li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين وكذلك في إشارة الكالسيوم. هنا ، وقد وصفت لنا نظام التجريبية التي تسمح لنا للتصدي بشكل مباشر على دور قناة واحدة الكالسيوم + 2 تسرب محتمل لتوصيف وآلياتها التنظيمية المفترضة 13. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا 2 + هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا 2 + السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة. نلاحظ أنه ينبغي تحليل الخلايا الوحيد القابل للتطبيق والجدوى الشاملة التي يجب أن تكون فوق 80 ٪. لذلك ، يتم تقييمها بشكل روتيني بقاء الخلية توظيف النووية معرف بقاء الخلية الزرقاء / الخضراء كاشف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. وعلاوة على ذلك ، والتحليل الإحصائي للتغيرات في عصاري خلوي كا 2 + تركيز إلزامي. لذلك ، يجب أن تكون التجارب التي أجريت على أربع دفعات مختلفة من الخلايا وcoverslips مع اثنين لا يقل عن 20 خلايا لديك ليتم تحليلها من أجل كل حالة في تجربة واحدة. نلاحظ أن التجارب المختلفة والتي يتعين الاضطلاع بها في نفس الوقت بعد البذر على زلات الغطاء.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td><td> PAA </td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> روش تشخيص </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> معرف النووية الأزرق / الأخضر كاشف بقاء الخلية </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> ENZ - 53004 </td></tr><tr><td> FURA ، 02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F - 1221 </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما </td><td> ف 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T - 7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin A </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> ALX ، 270-109 </td></tr><tr><td> تريفلوبيرازين </td><td> سيغما </td><td> تي 6062 </td></tr><tr><td> كونتيسة ® الآلي خلية مكافحة </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> الاعصار الثلاثي نظام التصوير </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td></td></tr><tr><td> TE2000 - S المجهر مع DS - 5Mc الكاميرا </td><td> نيكون </td><td></td></tr><tr><td> iMIC المجهر الخامس مع الملون </td><td> حتى الضوئيات </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

في خلايا الثدييات ، وشبكية هيولي باطني (ER) يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي البروتين والكالسيوم وكذلك في إشارة 1. وheterotrimeric Sec61 معقدة في الغشاء ER يوفر مسارا مائي لالبروتينية حديثا توليفها في التجويف من لائحة. العمل الأخير من مختلف المختبرات واقترح أن هذا المجمع قد تشكل أيضا heterotrimeric كا عابر 2 + قنوات تسرب 2-8. كانت الملاحظة الرئيسية لهذه الفكرة التي تطلق من البروتينية الوليدة من الريبوسوم والمعقدة التي Sec61 بوروميسين يؤدي إلى الإفراج عابر كا 2 + من لائحة. علاوة على ذلك ، فقد لوحظ في المختبر أن يشارك البروتين اللمعية ER بيب في منع نفاذية أيون على مستوى 9،10 Sec61 المجمع. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة مباشرة لدور مجمع Sec61 المحتملة كما كا قناة + 2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة 11-13. هذا النظام يجمع بين إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية كا 2 + التصوير 13. تعامل مع الخلايا siRNAs الموجهة ضد الترميز والمنطقة غير المترجمة (UTR) على التوالي ، من الجينات أو SEC61A1 سيرنا السيطرة السلبية. في تحليل تكامل ، هي الخلايا المشترك مع ناقلات transfected IRES - GFP التي تسمح للمقاومة سيرنا التعبير عن الجينات SEC61A1 wildtype. ثم يتم تحميلها على الخلايا التي تحتوي على الكالسيوم ratiometric - 2 + مؤشر FURA - 2 لرصد التغيرات في وقت واحد في عصاري خلوي كا 2 + التركيز في عدد من الخلايا عبر مجهر مضان. القياس المستمر للعصاري خلوي كا 2 + يسمح أيضا لتقييم تأثير عوامل مختلفة ، مثل بوروميسين ، مثبطات جزيء صغير ، وعلى thapsigargin كا 2 + التسرب. هذا النظام التجريبي يعطينا فرصا فريدة لط) تقييم مساهمة مختلف البروتينات إلى غشاء ER السلبي كا 2 + هروب من لائحة في مختلف أنواع الخلايا ، والثاني) توصيف البروتينات والآليات التي تحد من هذا كا 2 + السلبي هروب رأس المال ، و ج) دراسة آثار الطفرات المرض المرتبط في العناصر ذات الصلة.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

في شبكية هيولي باطني يلعب دورا رئيسيا في نشوء حيوي في البروتين والكالسيوم. لقد أنشأنا نظاما التجريبية التي تسمح لنا لمعالجة دور قنوات + CA2 وتسرب لتوصيف آلياتها التنظيمية المفترضة. هذا النظام ينطوي على إسكات الجينات بوساطة سيرنا والخلية الحية CA2 + التصوير.

يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

الأجرعية بوساطة الفيروسات إسكات الجينات المستحثة الفحص في القطن

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

التصوير المباشر من الكالسيوم مع ER-المستهدفة استريز المستحثة صبغ تحميل (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة<sup&gt; 2+</sup&gt; الاستشعار الماسك<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...