Name: live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

SL נתמך על ידי מענק של DFG (בית הספר למוסמכים מחקר 845). עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של DFG (SFB 530/C1 &amp; עבור 967) ועל ידי HOMFOR.

1. ההכנה של פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סידן ללא חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM EGTA, 10 גלוקוז מ&quot;מ 10 mM HEPES-KOH, (pH 7.35)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize FURA 02:00 ב-DMSO להשיג 1 מניות פתרון מ&quot;מ. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא צהוב בהיר homogenously. הגן על כוס מן האור. לדלל את FURA, 02:00 פתרון המניה שונה לתוך 1 מ&quot;ל של נשר Dulbecco בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין לריכוז סופי של 4 מיקרומטר לטעינה של תאים הלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12.5 mM puromycin מניות פתרון במים מזוקקים (pH 7.0). חנות aliquots ב -20 ° C. לדלל את puromycin 12.5 mM מניות פתרון במאגר סידן ללא ריכוז סופי של puromycin 500 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים thapsigargin ב DMSO לקבל 1 במלאי פתרון מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize 1 מ&quot;ג ophiobolin בכלורופורם 20 μl, ולאחר מכן, לערבב עם DMSO 25 μl. צינור microcentrifuge נשאר פתוח עד כלורופורם הוא התאדה. כך ophiobolin הסופי הריכוז הוא 100 מ&quot;מ. חנות aliquots ב -20 ° C. לפני השימוש, לדלל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר. לפיכך, הריכוז הסופי DMSO הדמיה תא חי אינו עולה על 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים trifluoperazine ב DMSO לריכוז של 10 מ&quot;מ aliquots חנות ב -20 ° C. מדולל פתרונות מניות למאגר, סידן חופשי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לפני השימוש. לכן ריכוז DMSO הסופי הדמיה תא חי, כמו עבור ophiobolin, אינו עולה על 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את siRNAs (SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA ו siRNA שליטה) במים RNase חינם להכין 20 המניות פתרון מיקרומטר. מערבבים בעזרת מערבולת ולבחון solubilization לפי העין. חנות 50 aliquots μl ב -20 ° C. </li></ol> 2. Gene השתקה בתאים הלה על מנת לחקור את התרומה של חלבון מסוים ER Ca 2 + בזרימת, הגן בהתאמה יש השתיק ביעילות עם שני siRNAs שונה (איור 1). בנוסף, את ההשפעה של השתקה יש להתגבר על הביטוי של הגן סוג בהתאמה בטבע. בדרך כלל אנו משתמשים siRNAs כי מכוונים נגד קידוד ללא קידוד (UTR) באזור, בהתאמה, של הגן של עניין. העסקת UTR מכוונת siRNA מספקת דרך נוחה השלמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seed 5.2 x 10 5 הלה תאים (ATCC לא. CCL-2) בצלחת תרבות 6 ס&quot;מ עם תלוש 25 מ&quot;מ המכסה (טרום שטופלו 200 μl של פולי-L-ליזין (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עבור 1 ח) ב שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין ו לדגור על 37 ° C בסביבת humidified עם 5% CO 2 (נפח סופי 3.9 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect התאים עם SEC61A1 siRNA, SEC61A1 UTR-siRNA, או siRNA שליטה שלילי באמצעות HiPerFect מגיב בהתאם להוראות היצרן (הריכוז הסופי של siRNA: 20 ננומטר). בקיצור, להכין siRNAs טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך transfection בפועל: הוסף 20 μl transfection מגיב HiPerFect ל μl 4 של siRNA כל (20 מיקרומטר), כי הוא מומס 80 μl של OptiMEM. תערובת זו vortexed בעדינות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת siRNA (104 μl) dropwise של 5.2 seeded x 10 5 תאים הלה (3.9 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, שנה את בינונית (3.9 מ&quot;ל) ו transfect התאים בשנית עם תערובת siRNA זהה (104 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ההשתקה על ידי ניתוח כתם המערבי. זה צריך להיות מעל 80%. שטפו תאים בצלחת תרבית תאים של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וקציר אותם DMEM. ספירת התאים על ידי העסקת מונה אוטומטי הרוזנת Cell. Lyse התאים חיץ תמוגה התא (10 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 3 מ&quot;מ MgCl 2, 0.5% NP40) בתוספת קוקטייל פרוטאז-מעכב (3 מיקרוגרם / מ&quot;ל Pepstatin, 3 מיקרוגרם / Leupeptin מ&quot;ל, 3 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Antipain, 3 מיקרוגרם / Chymastatin מ&quot;ל) ומערבבים עם חיץ SDS-המדגם (60 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 6.8, SDS 2%, גליצרול 10%, 5% β-mercaptoethanol, 0.01% bromphenol כחול ) על מנת לקבל ריכוז סופי של 10.000 תאים / μl. דגימות מחממים על 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן, להוסיף קצת גלאס חרוזים מערבולת של 20 דקות ל-DNA שבר. Μl 20 נפרדת של כל דגימה על ידי Laemmli מסוג SDS-PAGE (בדרך כלל 15% polyacrylamid עבור ג&#39;ל המפריד). העברת חלבונים מופרדים על ידי קרום PVDF electroblotting (&quot;כתם רטוב&quot;) בשעה mA 400 קבוע למשך 3 שעות או לילה חיץ העברה (100 מ&quot;מ Glycin, 12.5 מ&quot;מ טריס-HCl). לאחר מכן, בלוק עם 5% (w / v) נמוך חלב מיובש שומן PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לחשוף את הכתם על הנוגדן הראשוני כנגד הסופית-C של Sec61α מ ארנב אנטי β-אקטין הנוגדנים מהעכבר. לשטוף את כתם ב-PBS TritonX-100 (0.05%) ו-twice ב PBS 5 דקות, בהתאמה. דמיינו את הנוגדנים ראשוני באמצעות ECL Plex עזים נגד ארנב IgG-Cy5 או ECL עזים אנטי עכבר Plex IgG-Cy3-המצומד ומערכת טייפון-Trio הדמיה בשילוב עם תמונה קוואנט TL תוכנה 7.0. במקרה של הגן SEC61A1, אפקט השתקה מקסימלית נתפסת בדרך כלל 96 שעות לאחר transfection הראשונה. הניסוי נציג מוצג באיור. 2. </li></ol> 3. השלמה של תאים הלה על מנת להציל את הפנוטיפ של השתקה SEC61A1, cDNA SEC61A1 היה מוכנס לתוך האתר שיבוט מרובים (MCS) של האתר pCDNA3-פנימי ערך ריבוזומלי (IRES)-GFP-וקטור המכיל את ציטומגלווירוס (CMV) האמרגן, MCS, IRES, בתוספת חלבון fluoresecent ירוק (GFP) רצף קידוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 48 שעות לאחר transfection siRNA הראשון, חילופי בינוני (3.9 מ&quot;ל) בפעם השנייה ולהפוך את התאים עם וקטור או ריק או SEC61A1 ביטוי פלסמיד באמצעות Fugene HD על פי פרוטוקול של היצרן (יחס הסופי של וקטור Fugene HD הוא 4 מיקרוגרם וקטור 16 μl Fugene HD). בקיצור, להכין פלסמידים טרי צינור microcentrifuge נפרד לפני הליך שינוי: הוסף 16 μl מגיב Fugene HD טרנספורמציה ל 4 מיקרוגרם של כל פלסמיד זה מומס 80 μl של OptiMEM. מערבולת זו בעדינות לערבב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים את תערובת פלסמיד (0.1 מ&quot;ל) dropwise את seeded 5.2 x 10 5 תאים הלה (3.9 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של ביטוי פלסמיד, מנות תרבות כפוף מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפני הדמיה סידן קציר. אם יש צורך להחליף DMEM ידי PBS עבור אותות הקרינה יותר טוב. הקלטת תמונות פלואורסצנציה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield ויש מעל 80%. תוצאה אופיינית היא באיור. 3. </li></ol> 4. תא חי סידן הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידה, להעביר את תלוש לכסות מצופה transfected תאים הלה צלחת נפרדת תרבות 3.5 ס&quot;מ. טען את התאים עם 4 מיקרומטר FURA, 02:00 ב 1 מ&quot;ל DMEM 45 דקות במהירות של 25 ° C ב 11,12 כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן 25 מ&quot;מ לכסות להחליק בתא מתכת iMIC ולשטוף תאים פעמיים דגירה של חיץ, סידן חינם (בכל פעם 300 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל באיסוף נתונים על מיקרוסקופ iMIC צבעוני עם V על ידי מרגש לסירוגין 340 nm ו 380 nm ומדידת הקרינה הנפלטת ב 510 ננומטר (מערכת סינון: beamsplitter, 565 nm;, פולט ננומטר 605/70). לדוגמה תמונות המכיל 20-50 תאים / כל מסגרת 3 s. שיא FURA-2 אותות כמו יחסי F340/F380, שם F340 ו F380 מתאימות עוצמת הקרינה, הרקע מופחתים ב 340 ו 380 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דקות 1, לטפל בתאים עם puromycin (500 מיקרומטר) במאגר, סידן חופשי או עם חיץ זהה. לחילופין, לטיפול בתאים עם מעכבי מולקולה קטנה (כגון trifluoperazine 10 מיקרומטר או 100 מיקרומטר ophibolin) או עם חיץ סידן חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי מדידות ratiometric מבוצעות עבור 2 או 10 דקות, להוסיף thapsigargin (1 מיקרומטר) ולהמשיך את המדידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר, cytoslic [Ca 2 +] מוערך ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה. 2 ניתוח נתונים של Excel 2007 ומוצא 6.1. </li></ol> 5. נציג תוצאות: עד כה, אנו התייחס לשאלה האם ההשתקה של הגן SEC61A1 משפיע סידן (Ca 2 +) דליפה של ER (איור 1). הגן SEC61A1 הושתק על ידי שני siRNAs שונה בתאים הלה למשך 96 שעות. בעוד השתקה צמיחת תאים מושפע כמעט ואת הכדאיות, תחבורה חלבון לחדר מיון של חצי permeabilized תאים כמעט לחלוטין עכבות. יתר על כן, התאים השתיק SEC61A1 הושפעו קשות לגבי זליגת Ca + 2 מ ER. ההשפעה של השתקת הגן התהפכה על ידי הביטוי של הגן SEC61A1. לפיכך, Sec61 קומפלקסים שנמצאים בקרום ER של התאים בעלי הגרעין טופס Ca 2 + ערוצי דליפה כי ניתן לצפות לשחק תפקיד מכריע Ca 2 + הומאוסטזיס. עם זאת, נוכחות גדולה, נקבוביות המלאות במים עם חדירות יונים לא מבוקרת, כפי שנוצר על ידי Sec61 מתחמי בקרום ER, היה ברצינות להפריע לשחרור מוסדר של Ca 2 + מ לומן ER לתוך cytosol, מנגנון חיוני תאיים איתות. זיהינו מוטיב (רמ&quot;א) calmodulin מחייב הסופית N-cytosolic של Sec61α יונקים כי CAM קשור אבל לא Ca 2 + ללא apocalmodulin עם זיקה nanomolar וספציפיות רצף. ברמה התאית, שני היריבים CAM שונים מגורה Ca <sup&gt; 2 + שחרור ER בנוכחות אך לא בהעדר Sec61 ערוצי (איורים 4 ו -5). זו האחרונה לא נצפתה כאשר Sec61 ערוצי נכחו שהכיל מוטציות מוטיב IQ של Sec61α. לפיכך, Ca 2 +-CAM מעורב הגבלת Ca 2 + דליפה של ER (איור 6). <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. תרשים זרימה. ראו טקסט לקבלת פרטים. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. ניתוח נתונים עבור השתקה יעילות. השתקת הוערך על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים אשר כוונו נגד Sec61α ו β-אקטין (טעינה מלאה). נוגדנים העיקריים היו דמיינו באמצעות ECL נוגדנים Plex משני דימות פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. ניתוח נתונים על יעילות transfection. תמונות נרשמו על מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמת CCD מקורר. יעילות טרנספורמציה ניתן לקבוע על ידי חלוקת מספר התאים המציגים GFP הקרינה על ידי תאים נספר במצב brightfield. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן לחיות התא של תאים הלה בנוכחות מלאה או SEC61A1-siRNA לבין קיומו או אי קיומו של Cam-אנטגוניסט ophiobolin תאים א הלה טופלו siRNA כנגד SEC61A1 (ב) או siRNA בקרה שלילית (א) עבור 96 שעות כפי שצוין. תאים אלה היו עמוסות מחוון סידן FURA, 02:00 ו מודגרות ב Ca 2 + חיץ חופשי המכיל 0.5 mM EGTA, אז חיץ או ophiobolin (Ophio) במאגר נוספה הדגירה התחדשו. לאחר 10 דקות, Ca 2 + שחרורו יזם יישום thapsigargin (TG) בהעדר Ca 2 + חיצוני ו הדגירה נמשכה. צילומי מסך מתוך הדמיה סידן מתמשכת נלקחו במועדים המצוין. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig5.jpg" alt="איור 5"/> איור 5. ניתוח נתונים עבור לחיות סידן ניסויים תא הדמיה. (א) ניתוח כמותי קינטי של סדרת ניסויים כמתואר באיור. 4A. Cytoslic [Ca 2 +] נאמד ממדידות יחס לפי שיטת כיול הוקמה 2. ההשפעה של thapsigargin מוצג בתרשים הבר. (BD) תאים שטופלו siRNA שליטה או המצוין SEC61A1-siRNA למשך 48 שעות ולאחר מכן הפך עם וקטור או שליטה (ג), או ביטוי SEC61A1 פלסמיד (ג), או ביטוי מוטנטי SEC61A1 פלסמיד (ד) כפי שצויין. לאחר 48 שעות, הדמיה ניסויים סידן בוצעו כמו תאנים 4 ו - 5 א. ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca 2 + ריכוז לאחר תוספת של thapsigargin בניסויים כגון שהוצגו מוצגים. ערכי p &lt;0.001 הוגדרו משמעותי על ידי מבחן t מזווג ו מסומנים על ידי שלוש כוכביות (***), ns, לא משמעותי. המספרים של תאים נותחו מסומנים. ערכים ממוצע מקבלים, ברים שגיאה מייצגים סטיות התקן של אמצעי (SEM). נציין כי דוגמאות אלה הותאמו מ נ&quot;צ. 13. <img src="/files/ftp_upload/2730/2730fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. נתונים אלו מעידים כי שחרורו של רשתות המתהווה מתסביך Sec61 אכן גורמת לשחרור סידן מן ER ויצירת nanodomain סידן סביב הפה cytosolic של מורכבות Sec61. סידן זה הוא מחויב calmodulin וסידן-calmodulin סוגר את מורכבות Sec61 &quot;.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li><li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+form+ER+Ca2++leak+channels,+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer's+disease-linked+mutations.">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li><li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation.">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li><li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וכן איתות סידן. הנה, יש לנו תיאר מערכת ניסויית המאפשרת לנו ישירות לכתובת תפקיד של אחד פוטנציאל ערוץ Ca + 2 לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה 13. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca 2 + בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca 2 + בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים. נציין כי רק תאים קיימא צריך להיות מנותח כי הכדאיות הכללית צריכה להיות מעל 80%. לכן, הכדאיות תא מוערך שגרתי העסקת גרעיני-ID כחול / ירוק הכדאיות התא מגיב על פי פרוטוקול של היצרן. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי של השינויים cytosolic Ca 2 + בריכוז היא חובה. לכן, הניסויים צריך להתבצע במשך ארבע קבוצות שונות של תאים ושני coverslips עם לפחות 20 תאים צריך להיות מנותח עבור כל תנאי בניסוי יחיד. נציין כי הניסויים השונים צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת אחרי זריעת על תלושי לכסות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> גרעיני-ID כחול / ירוק מגיב כדאיות התא </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> סיגמא </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Trifluoperazine </td><td> סיגמא </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> הרוזנת ® מונה תא אוטומטי </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> טייפון-Trio הדמיה מערכת </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S מיקרוסקופ עם מצלמה DS-5Mc </td><td> ניקון </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ עם iMIC צבעוני V </td><td> עד Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

בתאי יונקים, reticulum endoplasmic (ER) משחקת תפקיד מפתח biogenesis חלבון וגם סידן איתות 1. מתחם heterotrimeric Sec61 בקרום ER מספק נתיב מימית עבור פוליפפטידים החדש מסונתז לתוך לומן של ER. מחקר שנערך לאחרונה ממעבדות שונות הציע מורכבת זו heterotrimeric עלולות להיווצר Ca 2 + חולף ערוצי דליפה 2-8. תצפית מפתח רעיון זה היה כי שחרורו של פוליפפטידים המתהווה מן הריבוזום ו Sec61 מורכבים על ידי puromycin מוביל לשחרור זמני של Ca 2 + מ המיון. יתר על כן, לא נצפו במבחנה כי luminal ER חלבון BIP עוסקת במניעת חדירות יונים ברמה של Sec61 9,10 מורכבים. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו לפנות ישירות את תפקיד מורכב Sec61 כמו פוטנציאל ערוץ Ca + 2 לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המשוערת שלה 11-13. מערכת זו משלבת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca 2 + הדמיה 13. תאים מטופלים עם siRNAs כי מכוונים נגד קידוד האזור מתורגמים (UTR), בהתאמה, של הגן SEC61A1 או siRNA בקרה שלילית. בניתוח השלמה, התאים הם שיתוף transfected עם וקטור IRES-GFP המאפשר siRNA עמידים הביטוי של הגן SEC61A1 wildtype. ואז התאים נטענים עם ratiometric Ca 2 +-אינדיקטור FURA-2 לפקח בו זמנית שינויים cytosolic Ca 2 + ריכוז במספר התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידה רציפה של cytosolic Ca 2 + מאפשרת גם להעריך את ההשפעה של גורמים שונים, כגון puromycin, מעכבי מולקולה קטנה, ואת thapsigargin על Ca 2 + דליפה. זו מערכת ניסיונית נותן לנו את הזדמנויות ייחודי i) להעריך את התרומה של חלבונים שונים על ממברנת ER פסיבי Ca 2 + בזרימת מ ER של סוגי תאים שונים, ii) לאפיין את חלבונים מנגנונים המגבילים את Ca 2 + בזרימת פסיבי, ו ג) לחקור את ההשפעות של מוטציות מחלה מקושר המרכיבים הרלבנטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Reticulum endoplasmic ממלא תפקיד מרכזי ב biogenesis חלבון ו הומאוסטזיס הסידן. הקמנו מערכת ניסויית המאפשרת לנו כתובת תפקידו של ערוצי Ca2 + לדלוף לאפיין את מנגנוני ויסות המתרברבים שלהם. מערכת זו כוללת בתיווך siRNA להשתקת הגן ואת תא חי Ca2 + הדמיה.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...