Name: live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms
Uploaded: 2011-07-07T12:00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

SL была поддержана общение с DFG (Graduate исследовательская школа 845). Эта работа была поддержана грантами DFG (SFB 530/C1 И ДЛЯ 967) и HOMFOR.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling.">Calcium signalling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Lomax, R. B., Camello, C., Van Coppenolle, F., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+physiological+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum+of+pancreatic+acinar+cells.">Basal and physiological Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum of pancreatic acinar cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 26479-26485 (2002).</li><li>Van Coppenolle, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-translocon+complex+mediates+calcium+leakage+from+endoplasmic+reticulum+stores.">Ribosome-translocon complex mediates calcium leakage from endoplasmic reticulum stores.</a> J. Cell Sci. 117, 4135-4142 (2004).</li><li>Flourakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+calcium+leak+via+translocon+is+a+first+step+for+iPLA2-pathway+regulated+store+operated+channel+activation.">Passive calcium leak via translocon is a first step for iPLA2-pathway regulated store operated channel activation.</a> FASEB J. 20, 1215-1217 (2006).</li><li>Giunti, R., Gamberucci, A., Fulceri, R., Banhegyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+translocon+and+a+cation+channel+are+involved+in+the+passive+Ca2++leak+from+the+endoplasmic+reticulum:+a+mechanistic+study+on+rat+liver+microsomes.">Both translocon and a cation channel are involved in the passive Ca2+ leak from the endoplasmic reticulum: a mechanistic study on rat liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 462, 115-121 (2007).</li><li>Ong, H. L., Liu, X., Sharma, A., Hegde, R. S., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Ca2++release+via+the+ER+translocon+activates+store+operated+calcium+entry.">Intracellular Ca2+ release via the ER translocon activates store operated calcium entry.</a> Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 453, 797-808 (2007).</li><li>Amer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocon+closure+to+Ca2++leak+in+proliferating+vascular+smooth+muscle+cells.">Translocon closure to Ca2+ leak in proliferating vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 296, 910-916 (2009).</li><li>Tu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilins+form+ER+Ca2++leak+channels,+a+function+disrupted+by+familial+Alzheimer's+disease-linked+mutations.">Presenilins form ER Ca2+ leak channels, a function disrupted by familial Alzheimer's disease-linked mutations.</a> Cell. 126, 981-993 (2006).</li><li>Hamman, B. D., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiP+maintains+the+permeability+barrier+of+the+ER+membrane+by+sealing+the+lumenal+end+of+the+translocon+pore+before+and+early+in+translocation.">BiP maintains the permeability barrier of the ER membrane by sealing the lumenal end of the translocon pore before and early in translocation.</a> Cell. 92, 747-758 (1998).</li><li>Alder, N. N., Shen, Y., Brodsky, J. L., Hendershot, L. M., Johnson, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+underlying+BiP-mediated+gating+of+the+Sec61+translocon+of+the+endoplasmic+reticulum.">The molecular mechanism underlying BiP-mediated gating of the Sec61 translocon of the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 168, 389-399 (2005).</li><li>Aneiros, E., Philipp, S. E., Lis, A., Freichel, M., Cavalie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Ca2++signalling+by+Na+/Ca2++exchangers+in+mast+cells.">Modulation of Ca2+ signalling by Na+/Ca2+ exchangers in mast cells.</a> J. Immunol. 174, 119-130 (2005).</li><li>Gross, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC5+is+a+Ca2+-activated+channel+functionally+coupled+to+Ca2+-selective+ion+channels.">TRPC5 is a Ca2+-activated channel functionally coupled to Ca2+-selective ion channels.</a> J. Biol. Chem. 284, 34423-34432 (2009).</li><li>Erdmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+calmodulin+with+Sec61a+limit+Ca2++leakage+from+the+endoplasmic+reticulum.">Interaction of calmodulin with Sec61a limit Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> EMBO J. 30, 17-31 (2011).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

В клетках млекопитающих, эндоплазматический ретикулум (ER), играет ключевую роль в биогенеза белка, а также в кальциевой сигнализации. Здесь мы описали экспериментальная система, которая позволяет нам напрямую обратиться к роли одного потенциального Са 2 + канал утечки и охарактеризовать ее предполагаемых механизмов регулирования 13. Эта экспериментальная система дает нам уникальные возможности я) оценить вклад различных мембранных белков ER к пассивному Са 2 + истечение из ЭР в различных типах клеток, II) характеризуют белков и механизмы, которые ограничивают это пассивная Са 2 + истечения, и III) изучить последствия болезни связаны мутации в соответствующих компонентов. Заметим, что только жизнеспособные клетки должны быть проанализированы и что в целом жизнеспособность должна быть выше 80%. Таким образом, жизнеспособность клеток регулярно оценивается применением ядерного ID синий / зеленый реагент жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом производителя. Кроме того, статистический анализ изменений в цитоплазме концентрации Са 2 + является обязательным. Таким образом, эксперименты должны быть проведены в течение четырех различных партий клеток и два покровных, по крайней мере 20 ячеек должны быть проанализированы для каждого условия в одном эксперименте. Отметим, что различные эксперименты должны проводиться в то же время после посева на обложке скользит.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> DMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 31966 </td></tr><tr><td> OptiMEM + GlutaMAX </td><td> Invitrogen </td><td> 51985 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Biochrom </td><td> S0115 </td></tr><tr><td> Пенициллин / стрептомицин </td><td> ПАА </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> HiPerFect </td><td> Qiagen </td><td> 301707 </td></tr><tr><td> Fugene HD </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04709713 </td></tr><tr><td> Ядерная-ID синий / зеленый реагент жизнеспособность клеток </td><td> Энцо наук о жизни </td><td> ENZ-53004 </td></tr><tr><td> Фура-2 утра </td><td> Invitrogen </td><td> F-1221 </td></tr><tr><td> Пуромицин </td><td> Сигма </td><td> P 7255 </td></tr><tr><td> Thapsigargin </td><td> Invitrogen </td><td> T-7459 </td></tr><tr><td> Ophiobolin </td><td> Энцо наук о жизни </td><td> ALX-270-109 </td></tr><tr><td> Трифлуоперазин </td><td> Сигма </td><td> T 6062 </td></tr><tr><td> Графиня ® Автоматическая Счетчик сотовый </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Тайфун-Трио визуализации системы </td><td> GE Healthcare </td><td></td></tr><tr><td> TE2000-S микроскоп с DS-5Mc камеры </td><td> Nikon </td><td></td></tr><tr><td> IMIC микроскоп с полихромной V </td><td> До Photonics </td><td></td></tr></tbody></table>

live cell calcium imaging combined with sirna mediated gene silencing identifies ca2+ leak channels in the er membrane and their regulatory mechanisms

В клетках млекопитающих, эндоплазматический ретикулум (ER), играет ключевую роль в биогенеза белка, а также в кальциевой сигнализации 1. Гетеротримерные Sec61 комплекса в мембране ЭР обеспечивает водный путь для вновь синтезированных полипептидов в просвет ЭР. Последние работы из разных лабораторий предположил, что это гетеротримерные комплекс может также образуют переходные Ca 2 + каналы утечки 2-8. Ключевое наблюдение за этим понятием было то, что освобождение зарождающейся полипептидов из рибосомы и Sec61 комплекс пуромицином приводит к переходным выпуском Са 2 + из ER. Кроме того, было отмечено, что в пробирке ER просвета белка BiP участвует в предотвращении ионной проницаемости на уровне 9,10 Sec61 комплекса. Мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам напрямую обратиться к роли Sec61 комплекса в качестве потенциальных Са 2 + канал утечки и охарактеризовать ее предполагаемых механизмов регулирования 11-13. Эта система сочетает в себе миРНК опосредованного глушителей гена и живой клетки Са 2 + изображения 13. Клетки обрабатывали siRNAs, которые направлены против кодирования и нетранслируемой области (УТР), соответственно, SEC61A1 гена или отрицательный миРНК контроля. В дополнении анализа, клетки совместно трансфицированных IRES-GFP вектор, который позволяет миРНК устойчивые выражения дикого типа SEC61A1 гена. Затем клетки загружены логометрических Са 2 +-индикатор FURA-2 для контроля одновременно изменения в цитоплазме концентрации Са 2 + в число клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Непрерывное измерение цитозольного Са 2 + также позволяет оценить влияние различных агентов, таких как пуромицин, небольшие молекулы ингибиторов, а thapsigargin на Са 2 + утечки. Эта экспериментальная система дает нам уникальные возможности я) оценить вклад различных мембранных белков ER к пассивному Са 2 + истечение из ЭР в различных типах клеток, II) характеризуют белков и механизмы, которые ограничивают это пассивная Са 2 + истечения, и III) изучить последствия болезни связаны мутации в соответствующих компонентов.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms at JoVE

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Эндоплазматическая сеть играет ключевую роль в биогенеза белка и кальция гомеостаза. Мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам рассмотреть роль Са2 + каналы утечки и охарактеризовать их предполагаемыми регулирующих механизмов. Эта система включает в себя миРНК опосредованного глушителей гена и живой клетки Ca2 + изображений.

Живая изображений Кальций сотовый В сочетании с миРНК Отключение гена опосредованного Идентифицирует Ca 2 + Утечка каналов в мембране ЭР и их регулирующих механизмов

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Изучение мембранных биогенеза с люциферазы основе Пробирной Гена Репортер

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Агробактериальной вирус-индуцированного Пробирной Отключение гена В Хлопок

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Прямое изображение ЭР кальция с целевыми-эстеразы Индуцированные красителем (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Живая съемка Пробирной для оценки роли Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Хитозан / интерферирующих РНК наночастиц опосредованного молчания генов в развитии болезни Векторный личинки комаров

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Мейоза шпинделя оценка в мышь ооцитов по миРНК-обеспечиваемого молчания

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Мониторинг высвобождения кальция ER / SR с помощью целевого Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Сенсорный CatchER<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...