Name: generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant
Uploaded: 2011-05-27T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Эта работа проводится при поддержке Производство помощи клеточной терапии (контракта NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), специализированные центры для клеточной терапии грант NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ASBMT Молодые премии следователя (UG и СП), лейкемии и лимфомы общества Специальные научный сотрудник в области клинической премии исследований (UG) и Эми Strelzer Manasevit ученый премии (ОМЛ).

1. DC nucleofection <ol><li> Урожай моноцитарных контроллеры домена, которые были обогащены с использованием пластиковых приверженности, культивировали в течение 5 дней с помощью сотового Genix среде с IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) и далее созрел в течение 24 часов использования созревания DC цитокинов IL4 (1000U / мл), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml и PGE2 (1μg/ml) 1, нежным ресуспендирования с 3 мл пипетки передачи. </li><li> Граф жизнеспособной контроллеры домена с использованием трипанового синий, передачи в 3-кратным 15 мл пробирки с не менее чем 0.5x10 6 и не более 2х10 6 кл / трубы. </li><li> Центрифуга для РС 10mins @ 200г. За это время предварительно теплой сотовый Genix среде с созреванием DC цитокинов (СМИ DC созревания) - 2ml/well в трех скважинах 12-а тканевая культура рассматривается пластины в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора. </li><li> Как только клетки закончили спиннинг, аспирация супернатант и добавить соответствующие плазмиды ДНК, чтобы каждый из трубы в конечной концентрации 5 мкг ДНК / трубы. В этом случае добавить плазмиды, кодирующей IE1-РР65 к трубе № 1, Hexon-Пентон к трубе № 2, и EBNA1-LMP2-BZLF1 к трубе № 3. </li><li> Ресуспендируют ДК и ДНК с 100 мкл раствора nucloefection Amaxa, хорошо перемешать и трансфер в nucleofection кювет. </li><li> Место в кювет 4D nucleofector, выберите программу CB150 (Amaxa / Lonza), и нажать старт. </li><li> Сразу же после nucleofection добавить 500 мкл в 2 мл подогретого сотовый Genix DC созревания СМИ кюветы, аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 2-3 раза, и передача nucleofected РС подготовлена ​​12-луночного планшета содержащих оставшиеся 1,5 мл предварительно нагретого СМИ DC созревания. Трансфер в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора для дальнейшей 12-18hrs. </li></ol> 2. Т-клеток, стимуляция <ol><li> Урожай и считать nucleofected контроллеры домена, и облучать на 30Gy. Вымойте раз с 10 мл среды CTL (45% RPMI, 45% кликов EHAA, 10% ЭТС, 2мм Glutamax) и ресуспендируйте @ 3 х 10 5 контроллеров домена на мл CTL СМИ. </li><li> Бассейн минимум 7.5x10 5 (2,5 мл) и максимум 15x10 5 (5 мл) ДК содержащие каждый из плазмид и передача объединенных РС G-Rex устройства, которые затем будут помещены в инкубатор. </li><li> Для подготовки клетки ответчик использовать либо ранее замороженных МНПК или не соблюдают мононуклеарных клеток, которые остаются после выбора постоянного тока (следование или CD14 выбор). Оттепель клетки, трансфер в нагретого культуральной среде, мыть один раз с CTL СМИ. Ресуспендируют клеток в СМИ CTL, граф клеток и довести их до концентрации 2х10 6 клеток на мл. Возьмите 15x10 6 ячеек или 7.5ml и дополнения 30000U IL4 (1000U/ml -. Окончательным концом) и 300ng IL7 (10ng/ml - финальный конц.). </li><li> Передача 7.5ml из РВМС (15x10 6 ячеек) для G-Rex и пополнить биореактор с CTL СМИ, чтобы общий объем 30 мл. </li><li> Культура G-Rex в течение 6-7 дней при 37 ° С / 5% CO 2 увлажненный инкубатора. </li></ol> 3. Т-клеток расширения <ol><li> В день 6-7, 10 мл аспирата средств массовой информации, затем смешать клетки в оставшихся 20 мл среды с 10 мл пипетки и считать жизнеспособных клеток с трипановым синий. Если Есть &lt;50x10 6 пополнится свежим медиа + цитокинов. Если Есть&gt; 50x10 6 ячеек удалить 10 мл клеточной суспензии, переезд в новый G-Rex, а затем кормить как G-Rexs со свежими CTL СМИ + цитокинов. </li><li> Культура для дополнительных 4-6 дней. После достаточного клетки были расширены, выполните фенотипические и функциональные характеристики CTL и cryopreserve избыток для будущего использования. </li></ol> 4. Представитель Результаты: Схема нашей FDA утвержденных multivirus конкретных CTL процесса генерации показано на рисунке 1. В отличие от конвенции multivirus CTL протоколы, которые используют adenovectors и EBV-LCL, чтобы стимулировать вирус-реактивных Т-клеток, 2 мы пришли на смену инфекционным материалом вируса с ДНК плазмиды , которые кодируют несколько антигенов производным от каждого из вирусов 3. Чтобы стимулировать trivirus CTL, нами разработаны три multicistronic плазмид кодирования Hexon и Пентон аденовируса, IE1 и РР65 ЦМВ, и EBNA1, LMP2, а BZLF1 ВЭБ. Эти антигены были выбраны на основе поощрения клинические результаты наших собственных и других групп, показывающие, что Т-клетки, направленный против Adv-hexon и Пентон 2,4-6, а также ЦМВ-1E1 и ЦМВ РР65 являются защитными в естественных условиях 7. Для EBV, EBNA1 является иммунодоминантные CD4 + T-клетки-мишени антиген экспрессируется во всех EBV-связанных злокачественных опухолей и в нормальных ВЭБ-инфицированных клеток 8,9, LMP2 является иммуногенной на несколько типов HLA и выражается в самых EBV злокачественных новообразований, в то время как 10,11 BZLF1 кодирует иммунодоминантные, немедленное рано литического цикла антиген, который стимулирует CD4 + и CD8 + Т-клеток от большинства людей и, вероятно, важна для сотрудничестваntrol клеток репликация вируса 12. Для дальнейшей оптимизации наших методов производства мы сотрудничали с природой технологий, создавшим minimalized, антибиотиков (FDA-совместимый) плазмиды для стимуляции ЦТЛ 13,14. С помощью этой стратегии мы последовательно достичь nucleofection КПД&gt; 35% при сохранении высокой жизнеспособности клеток (данные не представлены) 3. Рисунок 2 показывает, что частота вирус-специфических Т-клеток в ответ на оптимизированных плазмиды ДНК, как измеряется IFNγ ELISpot, было больше, , чем в ответ на обычные pShuttle основе плазмиды экспрессии выражения же антигены (п = 8 аденовирус, п = 4 ЦМВ, и п = 2 EBV). Оптимальное соотношение DC: РВМС было важно для мощных стимуляция Т-клеток, как показано на рисунке 3, где отношение 1:50 производятся неоптимальной активации по сравнению с 1:20 S: R отношение (п = 2 доноров). Производство достаточного CTL номера с широкими специфичность антигена предпосылкой для клинической эффективностью против всех трех вирусов. Это достигается за счет CTL культуры в G-Rex, которая поддерживает превосходные Т расширение ячейки по сравнению с обычными 24-луночных планшетах (рис. 4а) 15, в то время как добавление IL4 и IL7 к культурам увеличивает репертуар и специфичность как показано на рисунке 4В где частота Т-клеток, реактивная против ЦМВ РР65 полученных HLA-A2 resticted NLV пептид был оценен в культурах, генерируемых в присутствии или отсутствии IL4 и / или IL7 16,17. Для оценки фенотипа и функциональных возможностей расширен клетки мы проводим проточной цитометрии анализа внутриклеточных цитокинов окрашивания / IFNγ ELISpot и Cr 51 анализов релиз на конечный продукт для криоконсервации / в инфузии. Обычно сгенерированный клетки поликлональных со смешанным населением CD4 + и CD8 + Т-клеток с антигеном-специфичность обнаруживается в обоих отсеках Т клетки. CTL способны убить вирусный антиген-клеток, экспрессирующих цели, но не вирус отрицательный частично HLA соответствие цели, указывая, что они не должны вызывать трансплантат против хозяина (GVHD) в естественных условиях (рис. 5). <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. RCTL поколение протокола. Во-первых, контроллеры домена являются nucleofected с вирусного антигена кодирования плазмиды и затем смешивается с аутологичной МНПК на R: S 10 или 20:1. Клетки разлагаются в G-Rex в течение 10-14 дней в присутствии IL4 и IL7, затем собирают, считая, проверены на функции, идентичность и стерильность, а затем криоконсервированных для клинического использования. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Оптимизированная плазмид ДНК вызывают превосходной активацию Т-клеток в пробирке. Контроллеры домена были nucleofected с оптимизированной, FDA-совместимые плазмиды кодирования Hexon и Пентон (Adv), IE1 и РР65 (ЦМВ), и EBNA1, LMP2, а BZLF1 (ВЭБ) или обычные плазмиды pShuttle кодирования же антигены. Они были использованы, чтобы стимулировать Т-клетки и специфичность была проанализирована IFNγ ELISpot 10 дней после стимуляции. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig3.jpg" alt="Рисунок 3"/> Рисунок 3 Оптимальное DC:. Соотношение T ячейки для CTL активации. Контроллеры домена от 2 доноров nucleofected со всеми тремя оптимизированы плазмид, а затем используются для стимуляции аутологичных МНПК в 1:20 или 1:50 DC: РВМС отношение. Частота реактивации Т-клеток была оценена на 10 день от IFNγ ELISpot. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig4.jpg" alt="Рисунок 4"/> Рисунок 4. Т-клеток расширение G-Rex использованием повышения цитокинов. Группа показывает, G-Rex устройства, а также появление на CTL мембраны газопроницаемых, оценивали с помощью микроскопа. Сравнение между сотовыми выход, достигнутых в культуре ткани конвенции рассматриваются пластины против G-Rex также показано на рисунке. Группа B показывает частоту ЦМВ пентамера положительные CTL, достигнутые в культурах расширен в наличии не цитокинов, IL4 один, IL7 один и IL4 + IL7. <img src="/files/ftp_upload/2736/2736fig5.jpg" alt="Рисунок 5"/> Рисунок 5. Фенотип и функции расширенного CTL. Группа показывает типичный пример фенотип расширен CTL multivirus, которые поликлональных смесью CD4 + (45% - помощник) и CD8 + (42% - цитотоксические) Т-клетки, из которых большинство (95%) выразили памяти маркер CD45RO + / CD62L +. Группа B показывает, что эти клетки являются специфическими для всех стимулирующих антигенов и полифункциональных по оценке внутриклеточного окрашивания цитокинов обнаружить производства IFNΓ и ФНО после антигена стимуляции. группы С показывает, что расширил CTL, являются действительными измеряется по 51 Cr анализа. Аутологичная LCL, либо самостоятельно, либо трансдуцированных с нулевого вектора или аденовирусного вектора выражения ЦМВ РР65 были использованы в качестве смолыполучает. Alloreactivity оценивалась с использованием аллогенных PHA взрывы в качестве мишени.

<ol>
	<li>Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+producing+capacity+as+markers+of+function:+a+cautionary+tale.">Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale.</a> J Immunother. 31, 359-369 (2008).</li><li>Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals.">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).</li><li>Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+DCs+to+generate+Multivirus-specific+T+cells+for+prevention+or+treatment+of+viral+infections+in+the+immunocompromised+host.">Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host.</a> Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hexon-specific+CD4+and+CD8+T-cell+epitopes+for+vaccine+and+immunotherapy.">Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy.</a> J Virol. 82, 546-554 (2008).</li><li>Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+lymphocyte+therapy+with+donor+T+cells+prevents+and+treats+adenovirus+and+Epstein-Barr+virus+infections+after+haploidentical+and+matched+unrelated+stem+cell+transplantation.">Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation.</a> Blood. 114, 4283-4292 (2009).</li><li>Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safe+adoptive+transfer+of+virus-specific+T-cell+immunity+for+the+treatment+of+systemic+adenovirus+infection+after+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation.</a> Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).</li><li>Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+cytomegalovirus+after+transplantation+is+correlated+with+immediate+early+1-specific+CD8+T+cells.">Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells.</a> J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).</li><li>Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+immunogenicity+of+Epstein-Barr+virus+latent-cycle+proteins+for+human+CD4(+)+T-helper+1+responses.">Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses.</a> J Virol. 75, 8649-8659 (2001).</li><li>Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EBNA1-specific+CD4++T+cells+in+healthy+carriers+of+Epstein-Barr+virus+are+primarily+Th1+in+function.">EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function.</a> J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).</li><li>Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+latent+membrane+protein+2+specificity+in+CTL+lines+from+patients+with+EBV-positive+nasopharyngeal+carcinoma+and+lymphoma.">Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma.</a> J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).</li><li>Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+responses+to+viral+infection+in+humans:+lessons+from+Epstein-Barr+virus.">Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).</li><li>Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immediate+early+and+early+lytic+cycle+proteins+are+frequent+targets+of+the+Epstein-Barr+virus-induced+cytotoxic+T+cell+response.">Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response.</a> J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).</li><li>Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+antibiotic-free+DNA+vaccine+vectors+utilizing+a+novel+RNA+based+plasmid+selection+system.">Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system.</a> Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).</li><li>Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pDNAVACCultra+vector+family:+high+throughput+intracellular+targeting+DNA+vaccine+plasmids.">pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids.</a> Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).</li><li>Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+production+of+antigen-specific+T-cells+for+pre-clinical+and+clinical+applications+using+Gas-permeable+Rapid+Expansion+cultureware+(G-Rex.">Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex.</a> Journal of Immunotherapy. , (2009).</li><li>Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+survival+of+activated+T+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).</li><li>Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+4+(IL-4)+or+IL-7+prevents+the+death+of+resting+T+cells:+stat6+is+probably+not+required+for+the+effect+of+IL-4.">Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4.</a> J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).</li><li>Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+restoration+of+immunity+against+Epstein-Barr+virus+infection+by+adoptive+transfer+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes.">Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).</li><li>Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gene-modified+virus-specific+T+lymphocytes+to+control+Epstein-Barr+virus-related+lymphoproliferation.">Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation.</a> Lancet. 345, 9-13 (1995).</li><li>Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+cytomegalovirus+(CMV)-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy.">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916-3922 (2002).</li><li>Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).</li></ol>

Хуан Ф. Вера консультант Производство Уилсон Вольф. Другие авторы не имеют соответствующего раскрытия информации.

Вирусные инфекции составляют существенную заболеваемости и смертности у пациентов, которые иммунитетом от своей болезни и ее лечении. После ГСК, например, инфекции, вызванные вирусом герпеса стойкие, такие как ВЭБ и ЦМВ, а также респираторные вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), хорошо известны, в то время как важность инфекций, вызванных Adv, BK вируса и человека вирус герпеса (HHV) -6 совсем недавно были оценены. Хотя фармакологические препараты являются стандартной терапией для некоторых инфекций, они имеют существенные токсичности, порождают устойчивые варианты, и часто неэффективны. Напротив, вирус-специфических Т клеток, полученных от доноров стволовых клеток оказались безопасными и эффективными для профилактики и лечения вирусной инфекции или болезни в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) установление 2,5,6,18-21. Тем не менее, более широкое внедрение иммунотерапии Т-клеток, в конечном счете ограничено стоимость, сложность и время, необходимое для CTL производства. Наш новый и быстрый подход для создания multivirus CTL, описанные в текущих рукописи, должны существенно усилить возможности цитотоксических Т-клеточной терапии вирусных заболеваний, что позволяет стратегию, чтобы стать стандартом лечения ослабленным иммунитетом хозяина. Использование плазмиды nucleofected контроллеры домена, как БТР позволяет презентации антигена с обеих MHC класса I и II без конкуренции со стороны вирусных векторов или даже из нескольких вирусных антигенов выражены в одной клетке с разных популяциях постоянного тока используются для каждой плазмиды 3. Использование Ил-4 / 7 увеличивает T выживания и пролиферации клеток, что соответственно повышает частоту и репертуар реагирования антиген-специфические Т-клетки 16,17. Наконец, культура в G-Rex резко снижает T апоптоз клеток при культуры. Газообмен (O 2 и СО в 2 выхода) происходит через кремниевые мембраны газопроницаемых в основании колбы, предотвращения гипоксии, позволяя большую глубину среды выше клеток, обеспечивая больше питательных веществ и разбавления отходы. Эта платформа также может быть распространено на дополнительные вирусов, когда защитные антигены идентифицированы.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> CellGenix </td><td> CellGenix </td><td> 2005 </td></tr><tr><td> IL4 </td><td> R + D Systems </td><td> 204-IL/CF </td></tr><tr><td> IL7 </td><td> Peprotech </td><td> 200-15 </td></tr><tr><td> Hyclone RPMI 1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td></tr><tr><td> Человек AB сыворотке </td><td> Долина биомедицинских Инк </td><td> HP1022 </td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> AAF-1001B и ААР-1001X </td></tr><tr><td> Nucleofection Kit </td><td> Amaxa / Lonza </td><td> V4XP-3012 </td></tr><tr><td> Плазмиды </td><td> NTC </td><td> н / </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> R &amp; D </td><td> 215-GM/CF </td></tr><tr><td> IL1 </td><td> R &amp; D </td><td> 201-LB-025 </td></tr><tr><td> IL6 </td><td> R &amp; D </td><td> 206-Ил-CF </td></tr><tr><td> ФНО </td><td> R &amp; D </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> PGE2 </td><td> Сигма </td><td> P6532-1мг </td></tr><tr><td> G-Rex </td><td> Уилсон Вольф Производство </td><td> AY11-00027 </td></tr></tbody></table>

generation of multivirus-specific t cells to prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant

Вирусные инфекции вызывают заболеваемость и смертность в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей. Мы и другие успешно создан и придают T-клетки, специфические для Эпштейна Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ) и аденовирус (Adv) с помощью моноцитов и EBV-преобразовано лимфобластоидных клетки (EBV-LCL) генно-модифицированных с аденовирусом вектор антиген представляющих клеток (БТР). Каких-то 2х10 5 / кг trivirus-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) распространились на несколько журналов после инфузии и, казалось, для профилактики и лечения даже тяжелых вирусных заболеваний, устойчивых к другим доступных методов лечения. Более полно выполнить этот обнадеживающий подход ограничен высокими издержками производства, сложности изготовления и длительного времени (4-6 недели EBV-LCL поколения, и 4-8 недель для CTL производства - всего 10-14 недели) для подготовки. Для преодоления этих ограничений мы разработали новые, GMP-совместимый протокол CTL производства. Во-первых, вместо adenovectors стимулировать Т-клеток, мы используем дендритные клетки (ДК) nucleofected с ДНК плазмиды кодирования LMP2, EBNA1 и BZLF1 (ВЭБ), Hexon и Пентон (Adv), и РР65 и IE1 (ЦМВ) в качестве антиген-представляющих клеток. Эти бронетранспортеры активировать Т-клетки, специфичные для всех стимулирующих антигенов. Во-вторых, культура активированных Т-клеток в присутствии ИЛ-4 (1,000 ед / мл) и IL-7 (10ng/ml) увеличивает и поддерживает репертуар и частота специфических Т клеток в наших линиях. В-третьих, мы использовали новые, газопроницаемых устройство культуры (G-REX), что способствует расширению и выживания большого количества клеток после однократного стимуляция, тем самым устраняя потребность в ВЭБ-LCLS и сокращения техник вмешательства. За счет внедрения этих изменений мы можем теперь производить multispecific CTL ориентации EBV, CMV, и Adv по цене на 10 6 клеток, уменьшается на&gt; 90%, а всего за 10 дней, а не 10 недель, используя подход, который может быть распространен на дополнительные защитные вирусных антигенов. Наши FDA утвержденных подход должен иметь значение для профилактики и лечения заявок на высокий риск аллогенных ГСК получателей.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant at JoVE.com

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Быстрый, простой и экономически эффективный протокол для поколения доноров полученных multivirus конкретных ЦТЛ (rCTL) для инфузий в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей риск развития ЦМВ, Adv или EBV инфекции. Этот производственный процесс GMP-совместимый и должны обеспечить более широкую реализацию Т-клеточной иммунотерапии за пределы специализированных центрах.

Генерация Multivirus конкретным Т-клеток по предотвращению / лечения вирусных инфекций после аллогенной трансплантации стволовых клеток

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Клиническое применение<em&gt; Спящая красавица</em&gt; И искусственный антиген-представляющие клетки генетически модифицировать T клеток из периферической и пуповинной крови

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Выявление ДНК мутации в Очищенная гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Вывод Т-клеток<em&gt; In Vitro</em&gt; От эмбриональных стволовых клеток мыши

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Автоматизированная Обогащение Ячейка Цитомегаловирус-специфические Т-клетки для клинического применения с использованием системы цитокинов захвата

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...